活性位点突变对A.ficuum植酸酶pH偏好性影响的研究

实验发现,突变G64E和K75E对Aspergillu.ficuum植酸酶的pH偏好有显著的影响、通过A.ficuum植酸酶活性中心的氨基酸残基对植酸作用机制的研究,利用结构分析对其进行解释。

植酸酶基因在嗜酸乳杆菌中的表达

植酸酶和嗜酸乳杆菌是重要的饲料添加剂,为获得产植酸酶的嗜酸乳杆菌菌株,克隆了大肠杆菌植酸酶基因,构建表达载体并转化嗜酸乳杆菌,对重组嗜酸乳杆菌进行发酵产酶并测定所产酶液的酶学性质,进一步研究重组嗜酸乳杆菌的耐酸性及植酸酶液的抗蛋白酶活性。结果表明:重组嗜酸乳杆菌发酵24 h植酸酶活性为984 U/mL,植酸酶的最适催化pH为4.5,最适催化温度为60℃。重组嗜酸乳杆菌在pH 2.0~4.5有一定的耐酸性,在pH 2.0条件下2 h的存活率为76.4%。植酸酶液用胃蛋白酶处理160 min后植酸酶液剩余85%的相对酶活,用胰蛋白酶处理160 min后剩余29%的相对酶活。上述研究结果为重组嗜酸乳杆菌后续应用研究提供了重要依据。

蛋白质分子表面氨基酸突变提高植酸酶Yi APPA的活性和热稳定性

为了提高植酸酶的活性和热稳定性,增加其在食品加工领域的应用潜力,对植酸酶Yi APPA进行同源模建,结合蛋白质分子表面氨基酸突变策略,选择位于分子表面的赖氨酸和甘氨酸进行定点突变,构建单位点突变体。通过活性和热稳定性筛选,获得活性和热稳定性显著提高的突变体K216R以及热稳定性提高的突变体K189R。通过有益突变位点叠加策略,进一步构建并表征组合突变体K189R/K216R的酶活力及热稳定性。结果表明:与Yi APPA相比,K189R/K216R于80℃半衰期由14.81 min延长至23.35 min,半失活温度由55.12℃提升至62.44℃,热解折叠温度由48.36℃提升至53.18℃。并且K189R/K216R于37℃、pH 4.5的酶活力由3959.98 U/mg提高至4469.13 U/mg。分子结构建模和分子动力学模拟的结果显示:K189R/K216R中引入了新的氢键,能够提高酶部分结构单元的稳定性,使其热稳定性得到提高;同时K189R/K216R的催化口袋体积增大是其活性提高的主要原因。本研究通过蛋白质分子表面氨基酸突变策略可有效提高植酸酶Yi APPA的活性和热稳定性,为植酸酶及其他类型酶的分子改造提供参考依据。

定点突变引入离子键提高植酸酶YiAPPA热稳定性的研究

本研究旨在通过定点突变引入离子键来提高植酸酶YiAPPA的热稳定性。对比YiAPPA与热稳定性优良的植酸酶r PhyXT52的分子结构,采用定点突变技术向YiAPPA中引入与rPhyXT52热稳定性相关的分子表面离子键,构建离子键突变体。通过热稳定性筛选,获得热稳定性显著提高的离子键突变体T209K/S220E/N237D。突变体T209K/S220E/N237D的酶学特性研究结果表明:突变体T209K/S220E/N237D于37℃、pH4.5的绝对酶活为3982.06 U/mg,与YiAPPA基本一致;T209K/S220E/N237D的最适反应温度、最适反应pH、pH稳定性以及蛋白酶抗性也与YiAPPA基本一致;与YiAPPA相比,T209K/S220E/N237D于80℃半衰期由14.81 min延长至24.72 min,半失活温度T_(50)^(30)由55.12℃提升至64.05℃,T_(m)值由48.36℃提升至55.04℃。分子动力学模拟显示,T209K/S220E/N237D中引入了新的离子键,提高了酶分子中构成这些离子键的氨基酸残基所在的结构单元的稳定性,从而提高了酶的热稳定性。本研究结果表明,向YiAPPA中引入离子键可有效提高其热稳定性,使其更适用于食品加工领域。本研究也可为植酸酶以及其他类型酶的热稳定性改造提供理论依据。

产植酸酶益生乳酸菌的筛选

【目的】分离筛选产植酸酶益生乳酸菌菌株。【方法】以发酵饲料、博扎、浆水为代表的发酵样品中,分离筛选出形态差异菌株,通过产酶筛选及16S rDNA分子鉴定,获得产植酸酶乳酸菌菌株,并通过耐酸、耐胆盐、耐肠胃液、自聚集力及抑菌分析对其进行评价。【结果】筛选出4株产植酸酶乳酸菌,其中菌株JS5植酸酶酶活高达0.83 U/mL,与植物乳杆菌菌株DSM 20174相似性为100%,确定该菌株为植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)。菌株JS5在pH值3条件下存活率高达100%,在胆盐浓度0.1%时JS5存活率为0.55%,在模拟肠液和胃液中,存活率分别为8.56%和0.38%,其活菌数均在1×10^(6)CFU/mL以上,达到发挥益生作用的最小活菌数要求。菌株JS5自聚集力为(9.69%±0.44%),可促进菌株在肠道定殖。菌株JS5发酵液对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌均有抑制作用。【结论】植保乳杆菌JS5产植酸酶较高,可在模拟肠胃液中存活,具有良好的细胞黏附能力和抑制病原菌生长,可用于益生的畜禽微生态制剂。

L-肉碱、纤维素酶和植酸酶组合效应对肉鸡营养物质表观代谢率和体沉积率的影响

试验旨在探究饲料中添加L-肉碱、纤维素酶和植酸酶组合效应对肉鸡营养利用率和体沉积率的影响。试验采用L9(34)正交试验设计,将270只1日龄AA肉鸡随机分为9组,每组3个重复,每个重复10只鸡,试验期7周。在玉米-豆粕日粮基础上添加L-肉碱(25、50、75 mg/kg)、纤维素酶(500、1 000、2000mg/kg)与植酸酶(150、250、350mg/kg)。结果表明:当3种饲料添加剂的组合为75mg/kg肉碱、1 000 mg/kg纤维素酶、150 mg/kg植酸酶时,能够提高肉鸡粗蛋白质(CP)、粗脂肪(EE)、钙(Ca)和磷(P)的代谢率,其中植酸酶是影响CP和P代谢率的主效因子,L-肉碱是影响EE和Ca代谢率的主效因子;当3种饲料添加剂的组合为25 mg/kg L-肉碱、500 mg/kg纤维素酶、250 mg/kg植酸酶时,可提高机体CP沉积率,植酸酶是影响机体CP沉积的主效因子;当组合为50 mg/kg L-肉碱、1 000 mg/kg纤维素酶、350 mg/kg植酸酶时,能够改善机体EE沉积率,纤维素酶是影响机体EE沉积的主效因子。由此可见,在本试验条件下,肉鸡日粮中添加75 mg/kg L-肉碱、1 000 mg/kg纤维素酶、150 mg/kg植酸酶,可提高肉鸡营养物质代谢率;添加25 mg/kg L-肉碱、500 mg/kg纤维素酶、250 mg/kg植酸酶,有利于肉鸡机体营养物质的沉积。

双功能域β-折叠桶植酸酶提高土壤有效磷含量研究

农业生产中过度使用无机磷肥引发了土壤板结等一系列问题,因此有必要寻找一种替代的可持续的磷肥来源。土壤有机磷主要以植酸的形式存在,植物不能直接吸收和利用。植酸水解释放植酸磷可提供一个生态友好型的解决方案。通过向土壤中添加来自Bacillus sp.HJB17的双功能域β-折叠桶植酸酶(phyHT),研究其在土壤中的稳定性,探究phyHT提高土壤有效磷含量、改善土壤理化性质以及促进植物生长的作用效果。结果显示,在湿润土壤中,土壤微生物对phyHT影响很小,phyHT可在较宽的温度(20~40℃)和pH值(6.0~9.0)范围内稳定存在12 h并发挥高效催化功能。外源性添加phyHT后:(1)土壤植酸含量减少了17.00%,有效磷含量增加了22.52%;(2)土壤pH下降,电导率上升,CaCO_(3)含量降低了3.55个百分点,土壤有机质、铵态氮和速效钾含量分别增加了10.54%、18.38%和27.49%;(3)小麦幼苗生长长度、干物质积累量以及芽、根部组织全磷含量均显著增加。因此,外源性添加phyHT能够促进土壤植酸水解,增加土壤有效磷含量,提高土壤磷素有效性,同时,在一定程度上改善土壤理化性质,促进植物生长。

基于活细胞仪优化毕赤酵母发酵生产植酸酶研究

为了进一步提高毕赤酵母发酵生产植酸酶的产量和原材料利用率,该文在毕赤酵母生产植酸酶过程中引入在线活细胞传感仪,在验证电容值与活菌浓度呈良好线性相关的基础上,通过在线活细胞仪反映的电容值、电导率值并结合氧消耗速率研究了营养盐添加量和诱导阶段甲醇流加速率对植酸酶产量的影响。结果表明,在营养盐添加量75%、甲醇最大流加速率1∶10(占空比)的工艺条件下,发酵终点植酸酶的最大酶活力和总酶活力分别达到16900 U/mL和853.39×10^(6) U,比优化前提高了29.8%和42.6%。

日粮添加植酸酶对猪生长性能、养分消化及气体排放的影响

试验旨在探讨日粮添加植酸酶对猪生长性能、养分消化及气体排放的影响。选择山东省广饶县某规模化养猪场的128头健康杜×长×大三元杂交猪作为试验对象,随机分为4组,对照组给予基础日粮,试验组A、B、C分别给予基础日粮+50、100、150 mg/kg植酸酶饲喂,每组4个重复,每个重复8头猪。预试期为7 d,正试期为28 d。与对照组相比,日粮添加植酸酶的各试验组猪试验末平均体重、平均日增重显著提高(P<0.05),料重比显著降低(P<0.05);各试验组猪粗蛋白、磷表观消化率显著提高(P<0.05);各试验组猪的甲烷、硫化氢和氨气等有害气体排放量显著下降(P<0.05);各试验组猪粪便中粗灰分及氮、磷、铁、钴、锌、铜等元素含量均显著下降(P<0.05)。基础日粮中添加150 mg/kg植酸酶可有效促进猪生长性能、提高表观养分消化率、降低有害气体和粪污排放量。

植酸酶高剂量添加条件下日粮不同微量元素含量对笼养肉鸡生长与屠宰性能的影响

试验旨在研究日粮高剂量添加植酸酶情况下不同微量元素含量对笼养肉杂鸡生长性能与屠宰性能的影响。将864只1日龄公鸡随机分为2个组(对照组日粮添加铜10 mg/kg,铁60 mg/kg,锰60 mg/kg,锌80 mg/kg,碘0.8 mg/kg,硒0.30 mg/kg;试验组微量元素添加量减半),每组8个重复,每个重复54只鸡。试验周期50 d。研究结果表明:日粮添加2000 IU/kg植酸酶,试验组日粮微量元素减量添加后能显著(P<0.01)改善肉杂鸡的耗料增重比与日均增重,但是对肉杂鸡日均采食量无显著改善(P>0.05)。日粮中不同的微量元素添加量对肉杂鸡的屠宰率、全净膛率、胸肌率、腹脂率均无显著(P>0.05)影响。总之,在植酸酶高剂量添加的情况下降低日粮微量元素添加量对笼养肉杂鸡生长性能无负面影响,对日均增重和耗料增重比有明显的改善作用。

在仔猪和肉鸡日粮中添加植酸酶的研究

断奶仔猪和肉雏鸡日粮含有较多植物性饲料原料,这些原料中含有各种抗营养因子。文章简要阐述了植酸酶的特性、作用机制以及3-植酸酶和6-植酸酶的去磷酸化作用,并列举了在肉鸡和仔猪日粮中添加植酸酶在提高动物健康、营养物质消化率和生长性能方面的有益作用。

不同形态植酸酶对育肥猪生长性能的影响

本试验旨在研究日粮中添加不同形态的植酸酶对育肥猪生长性能的影响。试验选用健康的体重相近(55±2)kg的15周龄外三元商品育肥猪520头,随机分成A、B、C、D 4组,每组10个重复,每个重复13头。试验周期为50d。A组为对照组,不添加植酸酶;B、C、D三组分别在日粮中添加不同形态的植酸酶,其中B组在添加包衣植酸酶(1 000U/kg),C组添加粉状植酸酶(1 000U/kg),D组添加微颗粒植酸酶(1 000U/kg)。试验结果表明,添加了包衣植酸酶的猪群各营养物质消化率显著高于其余各组,且平均日增重与料肉比均高于其余试验组。本试验可为育肥猪饲料的产品设计提供参数,提高育肥猪的经济效益。

无花果曲霉Aspergillus ficuum CN-92在半固态基质上产植酸酶的研究

对无花果曲霉ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｉｃｕｕｍＣＮ－９２在几种常用农副产品基质的培养基上产植酸酶特性的研究表明，适宜于该菌株产植酸酶的优良培养基组成为：麸皮、豆饼粉、硫酸铵及少量无机磷。一些单糖、双糖（如葡萄糖、乳糖等）和无机氮（如ＮＨ４Ｃｌ、ＮＨ４ＮＯ３等）不同程度地抑制植酸酶的合成。一些微量元素如Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｇ等对产酶无促进作用。半固态基质的适宜含水率为５０％，适宜ｐＨ为６．０。在上述条件下，于３０℃培养７２～７６ｈ，达到产植酸酶高峰。

无花果曲霉(A.ficuum)植酸酶功能区基因的克隆及生物学活性的测定

经改造的植酸酶功能区结构基因按正确的阅读框架融合到酿酒酵母 (S .cerevisiae)表达载体YFD59上的α-因子信号肽编码序列 3’端 ,并受PGK组成型启动子和ADH1终止子的控制。重组载体以乙酸锂方法转化酿酒酵母宿主菌株BJ1 991 ,经尿嘧啶筛选得到酵母转化子。限制性培养酵母转化子并测定表达产物的生物活性。研究证明 ,植酸酶基因功能区具有生物学活性。表达产物与完整植酸酶相比 ,其 pH适性相似 。

Asp·ficuum NRRL3135植酸酶分子生物学研究

对无花果曲霉的植酸酶分子结构、氨基酸残基功能及基因工程技术与酶的生物合成、调控等进行论述，并综述了植酸酶的研究、开发与应用前景．

无花果曲霉(Aspergillus ficuum 3.4322)植酸酶基因的克隆及序列分析

以无花果曲霉(Aspergillus ficuum 3.4322)基因组DNA为模板,用PCR方法扩增植酸酶基因(phyA)。将PCR产物克隆到pMD 18-T质粒中,用于DNA测序。DNA序列分析结果表明,基因全长1 509 bp,其中包括一个长105 bp的内含子。编码467个氨基酸,第1-19氨基酸为信号肽序列,成熟的植酸酶由448个氨基酸组成。与黑曲霉(Aspergillus niger)植酸酶(GenBank Accession:M94550)的氨基酸同源性为95.7%,与无花果曲霉(Aspergillus ficuum3.324)植酸酶(GenBank Accession:AY013315)的氨基酸同源性为98.9%,显示了植酸酶基因在不同菌株中的差异。

植物乳杆菌植酸酶理性设计及表达鉴定

植酸酶能将植酸水解成肌醇衍生物,并释放出无机磷酸,是一种重要的生物催化剂。植酸酶的热稳定性和比活性是决定其潜在应用价值的2个关键因素。该研究从植物乳杆菌中克隆到了具有233个氨基酸残基、高活性的植酸酶基因(LpPHY233),并在大肠杆菌中实现了高水平的异源表达,其表达水平是植物乳杆菌的800倍。基于理性设计的结果,通过二硫键工程显著提高了Lp PHY233的温度特性和催化性能。突变体Lp PHY233S58C/K61C的最适反应温度较Lp PHY233提高了15℃。此外,它还具有良好的pH特性和动力学参数,在食品加工和饲料添加剂领域具有较大的应用前景。该研究结果为植酸酶的进一步分子修饰和工业应用提供了坚实的理论基础。

植酸酶对日粮铜减量下肉鸡生产性能和Cu、Zn排泄量的影响

植酸是广泛存在于植物饲料原料中的抗营养物质,常与Cu^(2+)、Zn^(2+)、Fe^(2+)、Ca^(2+)、Mg^(2+)等离子螯合降低畜禽对矿物元素的生物利用率。植酸酶可以有效降解植酸,进而释放被螯合的金属元素,改善Cu、Zn等的利用率,同时降低排泄量。本试验旨在确定添加植酸酶对日粮Cu水平减量下肉鸡生产性能和Cu、Zn等元素排放效应的影响。试验选取1日龄体重均匀、健康的雄性肉仔鸡480只,随机分为3个处理组,每个处理8个重复。对照组(CON)饲喂标准试验日粮(Cu,8 mg·kg^(-1)),两个试验组日粮Cu添加水平分别为4 mg·kg^(-1)(50%Cu)和0 mg·kg^(-1)(0%Cu),同时添加1200 U·kg^(-1)植酸酶。测定肉鸡生产性能及血液、骨骼中Cu、Zn等元素含量,于4周和7周时进行代谢试验测定Cu、Zn表观利用率和粪便排泄量。结果表明,降低日粮铜水平下添加植酸酶对各阶段肉鸡的生产性能均无显著影响(P>0.05),各处理组间肝和胫骨中Cu、Zn沉积量均无明显差异(P>0.05),但对21 d肉鸡胫骨指数有促进作用(P=0.07),21 d时0%Cu组较CON组胫骨Mn含量显著升高(P<0.05);第4周两个Cu减量组肉鸡Ca、P和Cu、Zn、Mn的表观生物学利用率均显著提高(P<0.05),且Cu和Ca、P表观利用率提高呈现剂量效应,第7周50%Cu组Cu、Zn表观利用率显著高于CON组(P<0.05);与CON组相比,0%Cu和50%Cu组肉鸡4周龄Cu、Zn、Mn的排泄量均显著降低(P<0.05),7周龄时Cu排泄量显著减少(P<0.05)。综上所述,日粮中添加1200 U·kg^(-1)植酸酶在Cu水平降低至标准添加量的50%或0%时对肉鸡的生产性能没有明显影响,但可以提高日粮Cu、Zn的表观利用率,减少粪便Cu、Zn的排泄。

非植酸磷和植酸酶水平对京红1号商品蛋鸡43~62周龄产蛋性能和蛋壳质量的影响

试验旨在研究非植酸磷和植酸酶水平对京红1号商品蛋鸡43~62周龄产蛋性能和蛋壳质量的影响。试验选用产蛋率、体重相近的43周龄京红1号商品蛋鸡1152只,随机分为对照组、试验A组、试验B组、试验C组、试验D组、试验E组6个处理组,每组8个重复,每个重复24只,饲喂玉米-豆粕型饲粮,饲粮非植酸磷水平分别为0.24%、0.17%、0.17%、0.21%、0.21%、0.27%,植酸酶水平分别为750 U/kg、750 U/kg、1500 U/kg、750 U/kg、1500 U/kg、750 U/kg,预试期3周,正试期17周。结果显示:饲粮非植酸磷和植酸酶水平对蛋鸡平均日采食量、平均蛋重、平均日产蛋量、沙皮蛋率、不合格蛋率、蛋壳厚度无显著影响(P>0.05),而对蛋壳强度、蛋壳光泽度有显著影响(P<0.05),其中试验C组46~62周龄蛋壳强度显著高于试验A组和试验E组(P<0.05),试验D组51~52周龄蛋壳强度显著高于试验A、B、E组(P<0.05),试验C组49~50周龄、55~58周龄光泽度显著高于试验A组(P<0.05)。试验C组46~62周龄沙皮蛋率和不合格蛋率均最低。研究表明,玉米-豆粕型饲粮非植酸磷和植酸酶水平分别为0.21%、750 U/kg时,能够提高京红1号商品蛋鸡46~62周龄蛋壳强度和光泽度,降低不合格蛋率。

低磷饲粮中添加植酸酶对肉鸭生长性能、屠宰性能和血液生化指标的影响

试验旨在研究低磷饲粮中添加植酸酶对肉鸭生长性能、屠宰性能和血液生化指标的影响。采用单因子完全随机试验设计,将400只1日龄雄性Z型北京鸭随机分为4组,每组10个重复,每个重复10只鸭。对照组饲喂低磷饲粮,无机磷组在低磷饲粮中添加0.2%无机磷,植酸酶组在低磷饲粮中分别添加1 000、2 000 U/kg植酸酶,试验期42 d。结果表明:无机磷组和2 000 U/kg植酸酶组肉鸭各阶段体重、日增重和日采食量高于对照组(P<0.05),而无机磷组和2 000 U/kg植酸酶组间无显著差异;无机磷组和2 000 U/kg植酸酶组肉鸭胸肌率和腹脂率高于对照组(P<0.05),腿肌率低于对照组(P<0.05);无机磷组和植酸酶组(1 000、2 000 U/kg)肉鸭血清磷水平高于对照组(P<0.05),血清碱性磷酸酶含量低于对照组(P<0.05),无机磷组和植酸酶组无显著差异;1 000、2 000 U/kg植酸酶组肉鸭血清总胆红素高于对照组和无机磷组(P<0.05)。由此可见,低磷饲粮中添加植酸酶能有效改善肉鸭生长性能和屠宰性能,提高血清磷含量,降低血清碱性磷酸酶活性,植酸酶与非植酸磷的当量介于500~1 000 U/g,其中植酸酶适宜添加量为2 000 U/kg。