乙肝病毒A1762、G1764双突变是筛选男性HBsAg携带者肝癌最高危人群的生物学标记

目的探讨乙肝病毒A1762、G1764双突变是否可作为筛选HBsAg携带者肝癌最高危人群的生物学标记。方法对2 258名乙肝病毒无症状携带者进行前瞻性队列研究,其中HBV A1762、G1764双突变株组1 261人,野毒株组997人,跟踪随访队列,每6个月1次对观察对象抽血进行甲胎蛋白(AFP)检测及B超体检以检查肝癌发病情况。结果观察48个月,2 258名乙肝病毒无症状携带者中,共发生肝癌72例,突变株组64例,野毒株组8例,发病率分别为932.2/10万人年和203.5/10万人年,两组发病率差异有统计学意义(P<0.001),相对危险度(RR)为4.58。突变株组男性发病率1 827.8/10万人年,明显高于野毒株组的180.5/10万人年,两者比较差异有统计学意义(P<0.001),相对危险度为10.13。92.5%的男性病例有双突变;突变株组女性发病率为686.6/10万人年,高于野毒株组的233.3/10万人年,两组比较差异有统计学意义(P<0.05),但相对危险度仅为2.94。结论双突变是筛选男性HBsAg携带者中肝癌最高危人群的很好生物学标记,但对女性筛选肝癌高危人群的意义不如男性。

乙型肝炎病毒基本核心启动子区A1762T/G1764A突变检测的意义

目的探讨乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)基本核心启动子区(BCP)A1762T/G1764A联合突变在不同疾病中发生的差异及其与乙肝相关肝癌预后的关系。方法选择慢性乙肝(CHB)患者38例、乙肝肝硬化(LC)患者36例、乙肝相关肝细胞肝癌(HCC)患者74例,用巢式PCR扩增患者血清中HBV BCP区,直接测序法检测HBV BCP区变异,分析A1762T/G1764A突变与HBV复制、HBeAg表达和HBV感染不同阶段的关系,以及与HCC患者预后的关系。结果在148例患者中,A1762T/G1764A突变总体发生率为54.7%,乙肝相关HCC组中A1762T/G1764A突变发生率为79.7%,而CHB、LC患者分别为31.6%、27.8%,HCC组变异的发生率明显高于CHB组(P<0.05)和LC组(P<0.05);A1762T/G1764A突变组HBV-DNA载量与非突变组比较差异无统计学意义(P>0.05);HBeAg阳性组A1762T/G1764A突变发生率为41.4%,HBeAg阴性组为73.5%,HBeAg阴性组变异发生率明显高于HBeAg阳性组(P<0.05);HCC患者A1762T/G1764A变异组与非变异组之间无病生存期及总体生存期差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HBV核心启动子区A1762T/G1764A联合突变与HCC发生具有显著关系,该变异与血清HBV-DNA的复制水平无关,但与血清HBeAg表达水平有关,与乙肝相关HCC预后无显著关系。

HBeAg阳性慢性乙型肝炎初治患者BCP区A1762T/G1764A变异株定量检测结果分析

目的探讨HBeAg阳性慢性乙型肝炎初治患者BCP区A1762T/G1764A变异株定量检测的临床意义。方法通过单标记探针联合选择性阻断实时荧光定量PCR法精确定量检测97例HBV DNA阳性慢性乙型肝炎初治患者BCP区A1762T/G1764A变异株,并进行统计学分析。结果 97例HBeAg阳性患者变异株的含量会随着HBV DNA水平的升高而降低(P<0.01)。变异株含量同时与HBeAg水平呈显著相关,随着HBeAg水平的升高,变异株含量降低(P<0.01)。结论对HBV感染者的BCP区A1762T/G1764A变异株进行定量检测,可对患者病情的可能发展进行预测,从而可以采取有效的防治措施。

TDI-FP法分析肝细胞癌组织中HBV核心启动子双突变

目的:通过TDI-FP法检测肝细胞癌组织中HBV DNA核心启动子区A1762 T和G1764A双突变并分析二者之间的相关性,同时建立一种新的突变检测方法.方法:以20例肝细胞癌组织为研究标本,通过PCR扩增含有HBV DNA核心启动子区的DNA片段,然后用TDI-FP法检测R110或TAMRA标记ddNTP的FP值,鉴定nt1762和nt1764的基因型.结果:20例肝细胞癌组织中经HBV检测试剂盒鉴定后,18例为HBV感染阳性,阳性率为90%.经TDI-FP检测,其中有13例为T1762和A1764双突变型,1例为T1762-A1764/A1762-G1764突变杂合型,4例检测结果为阴性.经测序,阳性结果及突变杂合型与TDI-FP结果完全吻合,阴性结果中2例在nt1762前有8个核苷酸缺失突变,导致突变检测引物无法与模板结合,故产生TDI-FP检测出现假阴性结果.在肝细胞癌组织HBV DNA中,Ti762-A1764突变阳性率为75%,突变杂合型为5%,野生型为10%.结论:在肝细胞癌组织中,HBV感染率非常高,而且其核心启动子区出现nt1762和nt1764双突变率较高,提示双突变与肝细胞癌关系密切;同时本实验所建立的TDI-FP法操作快速简便,可以进行高通量自动化操作,具有进一步推广应用的前景.

细胞因子与肝癌关系的巢式病例对照研究

目的探索导致HBV基本核心启动子(BCP)双突变(A1762T,G1764A)株相关肝癌患者免疫压力降低的细胞因子,及其与肝癌之间的关系。方法按照巢式病例对照研究原理,从隆安县研究队列中选择同为感染HBV BCP双突变株者作为研究对象,其中的肝癌患者纳入病例组、HBsAg无症状携带者纳入对照组。采用流式免疫荧光法先后检测2004年和2019年所采集的研究对象血清中,已知被HBV诱导改变的免疫细胞所分泌的10个细胞因子,包括IL-1β、IL-2、IL-4、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-12、IFN-γ和IL-13;采用Mann-WhitneyU检验对数据进行统计分析。结果研究对象包括肝癌患者9例(病例组)、HBsAg无症状携带者10例(对照组)。2004年只有细胞因子IL-10的表达量在病例组和对照组间差异有统计学意义(Z=-2.167,P=0.030),IL-10在病例组和对照组的表达量分别为(4.718±2.075)pg/mL和(2.899±0.745)pg/mL。2019年病例组细胞因子IL-6、IL-10和IL-12的表达量均高于对照组(P值分别为0.041、0.020和0.003)。对于病例组,细胞因子IL-10在2019年的表达量[(11.433±7.242)pg/mL]高于2004年[(4.718±2.075)pg/mL],差异有统计学意义(Z=-2.693,P=0.007)。结论细胞因子IL-6、IL-10和IL-12与HBV BCP双突变株携带者发生肝癌有关;细胞因子IL-10表达量升高与HBV BCP双突变(A1762T,G1764A)株相关肝癌患者机体免疫压力降低有关。

BCP区和前C区突变检测在慢加急性肝衰竭中的临床价值

目的探讨检测乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)患者基本核心启动子区(basic core promoter,BCP)A1762T/G1764A和前C区G1896A突变的临床价值。方法选取2010年9月至2020年10月中国科学院大学宁波华美医院收治的403例慢性HBV感染患者,根据患者是否发生ACLF将其分为慢性乙型肝炎(chronic hepititis B,CHB)组(369例)和ACLF组(34例),并根据预后将ACLF组患者再分为缓解组和恶化组。采用多因素Logistic回归分析筛选发生ACLF的独立影响因素,并构建联合预测模型。绘制受试者操作特征曲线以评价该模型的诊断价值。结果ACLF组患者的年龄、总胆红素(total bilirubin,TBiL)、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、甲胎蛋白、凝血酶原时间均显著高于CHB组(P<0.05),乙型肝炎e抗原阳性率、白蛋白(albumin,ALB)均显著低于CHB组(P<0.05)。ACLF组和CHB组患者A1762T/G1764A突变率比较差异无统计学意义(P>0.05),ACLF组患者G1896A突变率显著高于CHB患者(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,年龄、TBiL、ALB、G1896A突变均是发生ACLF的独立影响因素(P<0.05)。以上4项指标联合诊断ACLF的曲线下面积为0.950,敏感度和特异性分别为88.24%和93.22%;缓解组和恶化组患者的A1762T/G1764A、G1896A突变率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论HBV相关ACLF患者的前C区G1896A突变率显著增高是ACLF发病的独立危险因素,而BCP区A1762T/G1764A突变与ACLF发病的关系可能并不紧密。

野生型及突变型乙型肝炎病毒X基因在pGEX-6P-2系统中的克隆、表达、纯化及免疫鉴定

构建野生型和A1762T/G1764A双突变型乙型肝炎病毒(HBV)X基因原核表达系统,为深入研究HBV X基因及其双突变后对HBV慢性感染者病情发展和肿瘤发生的作用奠定基础。从慢性乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因组DNA,经PCR扩增和基因测序,证实并获得野生型及A1762T∕G1764A双突变型HBV X基因。应用TA克隆及亚克隆技术将2基因分别插入pGEX-6P-2载体,构建pGEX-6P-2-hbvxw(野生型)及pGEX-6P-2-hb-vxm(A1762T∕G1764A突变型)重组表达载体;转化入宿主菌进行诱导表达;包涵体复性后,GSTrap FF蛋白纯化柱纯化带有GST标签的野生型和A1762T∕G1764A突变型HBV x抗原(HBxAg);应用SDS-PAGE、Westernblot和ELISA方法对表达的野生型和突变型HBxAg进行鉴定。结果SDS-PAGE证实本研究构建的2个表达系统均能高效表达目的蛋白;复性、纯化后野生型和突变型GST-HBxAg分别达到4.88mg/mL和5.07mg/mL;Western blot鉴定证实所纯化的野生型和突变型HBxAg均能被特异性的单克隆抗体所识别;ELISA方法检测显示2种抗原都能成功包被于微量滴定板上并与乙肝患者血清反应。证实本研究成功地构建了野生型和A1762T∕G1764A突变型HBxAg表达系统,为进一步研究A1762T∕G1764A基因突变对肿瘤发生学和慢性HBV感染者疾病进展的作用和分子机制奠定了基础。

乙型肝炎病毒原发性肝癌X区变异与外周血T淋巴细胞亚群的关系

目的:初步探讨乙型肝炎病毒(HBV)X区热点突变A1762T/G1764A与HBV相关性原发性肝癌(PLC)患者外周血T淋巴细胞亚群之间的关系。方法:使用流式细胞仪和全自动生化分析仪分别检测35例PLC患者外周血CD3^+、CD4^+和CD8^+T淋巴细胞亚群水平和肝功能相关指标,同时提取外周血HBV DNA,用巢式PCR扩增HBV X区,对PCR产物进行双向测序,分析HBV X区A1762T/G1764A位点突变情况。结果:成功扩增35例PLC患者血清HBV DNA,DNA载量在突变组与未突变组间存在明显差异(t=4.41,P<0.001)。高载量组中CD3^+、CD4^+、CD8^+T淋巴细胞所占百分比和CD4^+/CD8^+比值与低载量组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。突变组中CD3^+、CD4^+和CD8^+T淋巴细胞所占百分比和CD4^+/CD8^+的比值与未突变组比较,差异无统计学意义(P>0.05);突变组总胆红素(TBIL)、总蛋白(TP)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和未突变组比较无明显差异(P>0.05),但突变组丙氨酸氨基转移酶(ALT)高于未突变组(t=2.20,P=0.035)。结论:HBV X区A1762T/G1764A突变与外周血T淋巴细胞可能无直接关联,但能够引起较为严重的肝损伤。

HBV基本核心启动子区和前C区变异与肝病进展的关系

乙型肝炎病毒（HBV）感染是我国严重的卫生健康问题，目前大约有1．7亿慢性HBV感染者，约占世界慢性HBV感染者的一半。HBV基因组结构为部分环状双链DNA，全长约3．2kb，其核心启动子对于HBV的复制和形态构成发挥了关键性作用。