采用分子动力学模拟方法探究Ca2+对VWF-A2结构域稳定性的影响

目的探究Ca^2＋对VWF-A2结构域稳定性的影响。方法 A2和A2/Ca^2＋的晶体结构取自PDB数据库。通过恒力拉伸分子动力学模拟,比较分析Ca^2＋结合引起的构象变化、解折叠路径的差异以及酶切位点的暴露程度。结果 A2结构域的解折叠路径和酶切位点的暴露过程是力依赖的。Ca^2＋结合不影响A2结构域的前期解折叠,但由于α3β4-环链局部构象重排所致柔性降低,约束了β1-β4-β5片层的运动,导致进一步解折叠受阻而停留在中间稳态,影响酶切位点的充分暴露。结论力可诱导A2结构域中β5片层的解折叠使酶切位点暴露,而Ca^2＋的结合则通过稳定疏水核心结构,阻碍酶切位点的暴露,最终降低ADAMTS13的酶切效率。研究结果有助于加深对ADAMTS13酶切VWF-A2结构域进而调控VWF止血能力过程的理解,并为相关抗血栓药物设计提供指导。

自释放型细胞内运输载体LCA2结构域的制备与性质研究

蛋白质药物因其独特的优势,在疾病的预防和治疗中发挥了极其重要的作用,但大分子的特性阻碍了其对细胞内靶标的作用。现有的递送策略中,由于穿膜肽更适用于临床研究和治疗,逐渐成为了递送蛋白质药物最主要的工具。因此,开发安全有效的穿膜肽类递送载体对于生物医药的基础研究及临床应用具有重要意义。文中设计了一种基于肠毒素A2结构域的自释放型细胞内运输载体LCA2,该载体由连接子Linker、自释放酶敏感位点Cs与穿膜结构域LTA2三部分组成,并以荧光蛋白质mCherry为模式蛋白质来检测该载体的性质。电泳结果显示,从含有pET24a(+)-ma2重组质粒的工程菌中获得了高纯度的mCherry-LCA2融合蛋白,且低浓度的胰蛋白酶就可将mCherry从LCA2上有效地分离;荧光显微镜下观察到LCA2能将与之连接的mCherry运输到不同类型的细胞中,流式细胞仪检测到LCA2的运输能力具有一定的细胞差异性。共聚焦显微镜的荧光分析和Western印迹结果显示,LCA2载体将mCherry蛋白运送到内质网,Cs酶敏感位点被切开,模式蛋白质mCherry与LCA2分离并释放到细胞内。CCK-8结果表明,在给药剂量5~40μg/mL范围内,细胞增殖活力未见显著变化。上述结果证明,LCA2是一种安全有效的自释放型递送载体,能够将活性蛋白质或蛋白质药物运输到细胞内质网并释放。

液泡膜ATP酶亚基的N末端结构域与巨噬细胞集落刺激因子协同极化巨噬细胞影响胃癌细胞的增殖能力

目的探讨液泡膜ATP酶亚基的N末端结构域（a2NTD）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）对巨噬细胞极化的协同作用，以及极化的巨噬细胞对胃癌细胞增殖能力的影响。 方法分离健康人外周血单个核细胞，诱导培养巨噬细胞后分为4组：对照组（RPMI1640），实验Ⅰ组（M-CSF 100 ng/ml），实验Ⅱ组（a2NTD 500 ng/ml）和实验Ⅲ组（a2NTD 500 ng/ml加M-CSF 100 ng/ml），刺激48 h后应用双重免疫荧光标记法检测巨噬细胞膜表面抗原的表达，用ELISA法检测细胞因子IL-10和IL-12的分泌情况，并用CCK-8法检测巨噬细胞对胃癌SGC-7901细胞增殖能力的影响。 结果巨噬细胞膜表面抗原CD68在4组巨噬细胞膜上均有表达（＋），平均吸光度值（MD值）分别为：对照组0.092±0.005，实验Ⅰ组0.095±0.006，实验Ⅱ组0.094±0.005，实验Ⅲ组0.094±0.005 ，4组比较，差异无统计学意义（P〉 0.05）。CD206在对照组弱表达（-），MD值为0.025±0.004；在实验Ⅰ组和实验Ⅱ组均有表达（＋），MD值分别为0.191±0.012和0.197±0.136，在实验Ⅲ组超强表达（＋＋＋），MD值为0.285±0.011；除实验Ⅰ组与实验Ⅱ组比较差异无统计学意义（P〉 0.05），其余各组两两比较，差异均有统计学意义（均P〈 0.01）。实验Ⅰ组和实验Ⅱ组细胞分泌IL-10水平分别为（85.65±13.64） ng/L和（87.77±14.25）ng/L，均高于对照组[（71.67±7.56）ng/L，P 〈 0.01] ；分泌IL-12水平分别为（9.91±1.50）ng/L和（10.15±1.80）ng/L，均低于对照组[（16.87±1.10）ng/L，P〈 0.01]。实验Ⅲ组分泌IL-10水平为（116.98±14.27）ng/L，高于其余各组（均P〈 0.01）；分泌IL-12水平为（5.31±0.88）ng/L，低于其余各组（均P〈 0.01）。析因分析显示，在对IL-10和IL-12分泌量的影响上，a2NTD和M-CSF具有交互效应（均P 〈0.05）。各组巨噬细胞均能加快胃癌SGC-7901细胞的增殖，且实验Ⅲ组巨噬细胞对胃癌SGC-7901细胞增殖速度的促进作用明显强于其他各组（均P〈 0.01）。 结论a2NTD与M-CSF在促使巨噬细胞极化及细胞因子分泌上具有协同作用，协同极化的巨噬细胞能明显增强胃癌细胞增殖能力。