小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因表达检测及真核表达载体构建

目的检测及克隆小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因,构建真核表达载体。方法设计寡核苷酸探针,应用原位分子杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因的mRNA表达,RT-PCR法从A20细胞总RNA中获取mCD99L2 基因含编码区全长cDNA,克隆入T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定并经序列测定;设计含酶切位点的PCR引物,PCR 获取含mCD99L2基因编码区片段,用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切取所需目的片段,利用分子克隆技术与 pcDNA3．1／MycHis C(+)质粒重组,对产生的重组子进行PCR、双酶切鉴定,并经过测序证实。结果原位杂交方法检测 A20细胞中mCD99L2基因mRNA呈阳性表达;RT-PCR法成功获得mCD99L2基因编码区全长cDNA序列,DNA序列测序结果与GenBank提供的已知序列(NM-138309)比较,结果完全一致;重组质粒pcDNA3．1-mCD99L2中的插入片段经DNA测序后与GenBank中mD99L2基因相应序列比较,100％同源。结论小鼠B淋巴瘤A20细胞株存在 mCD99L2基因,采用RT-PCR和T-A技术克隆了A20细胞的mCD99L2基因,成功构建了pcDNA3．1-mCD99L2真核表达载体,为下一步探索mCD99L2基因在小鼠B淋巴瘤A20细胞株中的功能奠定了实验基础。

荧光素酶标记A20鼠B细胞淋巴瘤移植模型的建立

目的:建立荧光素酶标记A20鼠B细胞淋巴瘤移植模型,为后期异基因造血干细胞移植中移植物抗肿瘤作用的研究提供实验工具。方法:将萤火虫荧光素酶作为标记基因导入A20鼠B细胞淋巴瘤细胞株,建立稳定表达荧光素酶的A20细胞株;将其与C57BL/6小鼠骨髓经尾静脉共同接种于辐射后的BALB/c小鼠体内,建立移植肿瘤模型;用活体荧光成像系统检测肿瘤的发生发展,并观察小鼠的活存,体重变化以及成瘤部位;取肿瘤组织和动物脏器行石蜡包埋、病理切片、HE染色观察其组织学特点。结果:经慢病毒转染和嘌呤霉素筛选获得了稳定表达荧光素酶基因的A20细胞株。活体荧光成像观察发现,在A20细胞接种第8天,即可观察到肿瘤发光,随着观察天数的增加荧光强度增强。相比较于骨髓移植(BMT)组,BMT+A2 0-Luc^+组小鼠存活率下降,体重降低明显。大体解剖显示,成瘤部位主要波及肝脏和脾脏,成瘤组织特征类似人弥漫大B细胞淋巴瘤。结论:成功构建了荧光素酶标记A20鼠B细胞淋巴瘤移植模型,为探讨异基因造血干细胞移植中移植物抗肿瘤作用提供了研究平台。

不同方式构建A20鼠B细胞淋巴瘤动物模型

目的探索多种方式构建A20鼠B细胞淋巴瘤动物模型及不同方式造模成瘤的特征。方法鼠源性B细胞淋巴瘤细胞株A20经皮下、尾静脉、脾脏和腹腔接种于同源BALB/c小鼠或先接种裸鼠成瘤后组织块移植BALB/c小鼠,观察动物成瘤时间、成瘤率、成瘤部位;取肿瘤组织和动物脏器行石蜡包埋、病理切片、HE染色观察其组织学特点。结果BALB/c鼠皮下注2×106组、2×107组和裸鼠瘤组织移植BALB/c小鼠组成瘤率皆为100%,成瘤时间分别为(15.29±3.2)d(、7.0±0.82)d和(6.29±0.49)d。BALB/c小鼠尾静脉注射2×106组、2×107组、脾脏注射组、腹腔注射组成瘤率分别为71.4%、100%、71.4%、14.3%,成瘤时间分别为(76.8±12.0)d、(26.1±7.99)d、(32.6±5.99)d和27 d。尾静脉成瘤部位播及肝脏、脾脏、胰腺、肾脏、食道、胃、肠、肠系膜、脑、淋巴结、骨、子宫、肌肉等多脏器和组织。BALB/c鼠A20成瘤组织学类似人弥漫大B细胞淋巴瘤。结论成功构建A20皮下移植瘤模型、血行播散性模型,为利用有免疫功能动物进行B淋巴瘤相关研究提供了实验平台。

RNA干扰A20基因的表达对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、凋亡和迁移的影响

目的利用RNA干扰技术靶向沉默A20基因,对MCF-7细胞株增殖、凋亡和迁移的影响进行研究,探讨A20基因作为乳腺癌治疗靶点的潜在价值。方法人工合成靶向A20基因的siRNA序列和阴性对照(NC)siRNA序列,利用脂质体转染技术将siRNA导入MCF-7细胞株,采用CCK-8细胞增殖实验、Annexin V、7-AAD双染流式细胞术检测凋亡实验和Transwell细胞迁移实验研究沉默A20基因对MCF-7细胞增殖、凋亡和迁移的影响。结果靶向沉默A20基因表达能够有效抑制MCF-7细胞的增殖和迁移,促进细胞凋亡的发生。结论 A20基因在MCF-7细胞的增殖、凋亡和迁移过程中起重要作用,A20基因可能是针对乳腺癌抗肿瘤靶向治疗的潜在靶点。

小鼠B淋巴瘤细胞系A20核转染的影响因素分析

目的分析影响小鼠B淋巴瘤细胞系A20的核转染效率的因素,以提高转染效率。方法2017年1-6月在武汉大学人民医院中心实验室和肾病实验实进行实验。以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,使用Nucleofector核酸转染方法分别转染4种外源基因即CD40、ARNO、C-ABL JLP进入A20细胞,用流式细胞术和荧光显微镜分别检测转染效率,研究细胞转染时间和外源质粒大小对核转染效率的影响。结果质粒大小在8 kb以下时转染效率均很高,质粒超过8 kb时转染效率较低,其中,ARNO组(目的基因长度为1 366 bp)转染效率最高,JLP组(目的基因长度为3 976 bp)转染效率最低,转染后4 h检测转染效率最高,48 h时最低。结论核转染方法非常适合于悬浮细胞的转染。且相对于传统的脂质体转染等方式,核转染的方法能有效缩短转染时间。外源基因过大会导致转染效率低,控制外源基因的大小能有效提高转染效率。

A20基因在神经母细胞瘤细胞系中的抗凋亡作用

目的A20基因是一种肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导下的原始反应基因。其编码的锌指结构蛋白在抑制NF-κB和TNF-α介导的细胞凋亡方面得到了广泛的研究。但对于其在神经系统中的作用研究较少。该实验采用脂质体转染及克隆筛选将A20基因导入神经母细胞瘤(SY-SH-5Y细胞系)中,通过体外实验观察A20-SY-SH-5Y细胞在抗凋亡方面的表现。方法SY-SH-5Y细胞系转染A20基因后,应用肿瘤坏死因子(TNF-α)刺激,采用流式细胞仪(FACS)测定细胞的死亡率,并进行DNA片断化分析(DNA Ladder)。结果实验表明:转染A20的SY-SH-5Y细胞系在TNF-α的诱导下死亡率小于对照组转染pCDNA3基因的SY-SH-5Y细胞系(P<0.05)。结论A20作为一种在细胞抗凋亡过程中发挥关键作用的基因,能够在神经母细胞瘤SY-SH-5Y细胞系中表现出较强抗凋亡能力,为临床上许多以凋亡为主要表现的神经系统疾病的治疗提供了新思路。

播散性鼠B细胞淋巴瘤动物模型的建立

目的在具有免疫能力的BALB／c小鼠上构建播散性B淋巴瘤动物模型。方法经尾静脉注射鼠源性B细胞淋巴瘤细胞株A20于同源BALB／c小鼠，0～3个月间观察动物成瘤情况；取动物脏器行石蜡包埋、病理切片、HE染色；流式细胞仪检测其CD19的表达。结果尾静脉注射2×10^6、2×10^7细胞于14只BALB／c小鼠，成瘤时间分别为76．8±12．0天和26.1±7．9天；总体成瘤率分别为71.4％（5／7）和100％（7／7）；在肝脏、脾脏、淋巴结、肠、肠系膜、下肢、颈部、子宫和臀部等多脏器成瘤；流式检测瘤组织细胞mCD19表达强阳性。结论运用尾静脉注射方法构建了内脏器官广泛发生的播散性B淋巴瘤BALB／c小鼠动物模型，为进一步进行B淋巴瘤相关研究提供了实验依据。

低表达mCD99L2鼠B淋巴瘤细胞亚系的建立及鉴定

目的:建立和鉴定稳定的低表达mCD99L2鼠B淋巴瘤细胞亚系,以探究mCD99L2基因在Hodgkin′s淋巴瘤H/RS细胞形成中的作用。方法:对前期构建的慢病毒质粒稳定干扰的A20-LV-mCD99L2克隆株进行体外培养,分别选择第10、20、30、40代细胞,DNA-PCR检测shRNA干扰载体的整合,RT-PCR及荧光定量PCR检测目的基因mCD99L2的表达水平,倒置显微镜观察A20-LV-mCD99L2细胞的形态变化并进行计数,免疫荧光观察H/RS样大细胞mCD30分子的表达。结果:第10、20、30、40代A20-LV-mCD99L2细胞(1)抽提DNA进行PCR均能检测出shRNA干扰载体稳定整合至A20细胞基因组;(2)RT-PCR及荧光定量PCR检测目的基因mCD99L2均较A20细胞呈低水平表达;(3)各代A20-LV-mCD99L2细胞中均发现有类似人H/RS细胞的大细胞(A20-H/RS);(4)免疫荧光检测H/RS样细胞mCD30呈阳性表达。结论:鉴定和建立了低表达mCD99L2基因的A20细胞亚系,该细胞亚系中存在类似人H/RS细胞的大细胞。

TNFAIP3 siRNA对弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-LY1细胞NF-κB活性及增殖的影响

目的探讨A20(TNFAIP3)基因对弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)细胞生长的影响及其与细胞内核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)活化的关系。方法采用RNA干扰技术沉默A20,设计3条针对人A20mRNA的siRNA序列,经过lipofectamine RNAiMAX转染至OCI-LY1细胞(DLBCL细胞),用RT-PCR技术检测转染后OCI-LY1细胞内A20 mRNA的表达,用Western blot法检测A20和NF-κB(p65)蛋白的表达。用MTT法检测A20基因沉默后OCI-LY1细胞体外生长活力变化。结果 (1)siRNA转染组A20 mRNA及编码蛋白表达较未转染组及阴性对照组明显降低(P<0.05);(2)转染组p65蛋白的表达较未转染组和阴性对照组明显增高(P<0.05);(3)转染组细胞较未转染组、阴性对照组的OCI-LY1细胞体外生长活力明显增强。三组siRNA序列中siRNA-2序列干扰效果最明显。结论 DLBCL细胞中A20基因沉默会导致NF-κB活性增强,从而增强淋巴瘤细胞的生长活力。

类似人弥漫型大B细胞淋巴瘤小鼠模型的免疫学特征

本研究建立类似人弥漫型大B细胞淋巴瘤的BALB/c小鼠模型并探索其免疫学特征。将鼠源性B淋巴瘤细胞株(A20细胞)接种于同源BALB/c小鼠以建立B细胞淋巴瘤鼠模型。实验分为3组:成瘤小鼠组,未成瘤小鼠组和正常小鼠组(对照组)。用流式细胞术检测肿瘤细胞CD抗原表达及成瘤小鼠、未成瘤小鼠和对照正常小鼠的外周血和脾脏的T/B淋巴细胞亚群比例。结果表明:在成功构建病理学形态类似人弥漫大B细胞淋巴瘤的BALB/c鼠模型肿瘤组织中,检测到CD3、CD4、CD8、CD19、CD30阳性细胞的比例分别为(49.27±23.75)%,(6.07±3.65)%,(51.2±23.1)%,(67.06±16.39)%,(37.93±17.03)%,与接种前A20细胞相比,其CD3和CD8阳性细胞比例显著升高,CD19阳性表达比例显著下降(p<0.05)。成瘤小鼠外周血淋巴细胞亚群阳性表达比例较正常小鼠有显著差异,其CD3和CD4阳性细胞比例显著降低(p<0.05)。未成瘤小鼠脾脏淋巴细胞亚群的阳性表达比例与正常小鼠相比,CD3、CD4、CD8阳性细胞比例降低,而CD19阳性细胞比例升高(p<0.05)。结论:本研究为在有免疫功能的小鼠体内进行B细胞淋巴瘤相关研究提供了免疫相关实验依据。

mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞A20生物学特性的影响

目的探究mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞生物学特性的影响。方法采用MTT法和流式细胞仪检测mCD99L2基因沉默前后干扰组A20-LV-mCD99L2和未干扰组A20细胞的增殖率和细胞周期;Transwell法测定两组细胞的体外侵袭能力;采用裸鼠与BALB/c鼠皮下成瘤实验观察比较两组细胞在体内的成瘤时间和成瘤率。结果MTT法显示干扰组A20-LV-mCD99L2增殖率为(0.61±0.12),低于未干扰组增殖率(0.75±0.20),差异有统计学意义(P=0.000);干扰组A20-LV-mCD99L2处于G2期的细胞比例为(10.58±4.97),高于未干扰组(3.33±1.31),差异有统计学意义(P=0.009);Transwell法显示干扰组A20-LV-mCD99L2运动能力较未干扰组下降。裸鼠皮下成瘤时间干扰组(13.33±4.63)d长于未干扰组(9.50±2.90)d,成瘤率均为100%;BALB/c鼠皮下成瘤时间干扰组(10d)长于未干扰组(7.0±0.82)d,成瘤率干扰组为14.3%,显著低于未干扰组(100%),差异有统计学意义(P=0.000)。结论mCD99L2基因沉默可抑制小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞的生物学行为,降低其在体外的增殖能力和运动能力,显著降低其在BALB/c鼠体内的成瘤率。