mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞转化为H/RS样细胞的影响

目的探究mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞转化为H/RS样细胞的影响。方法重组SiRNA表达质粒LV-mCD99L2,体外转染内源性mCD99L2表达阳性的A20细胞,筛选出稳定表达LV质粒的细胞株并扩增培养;采用免疫荧光技术和流式细胞仪检测转化前后两组细胞鼠源CD30表达;透射电镜观察转化后细胞超微结构的形态特点;细胞计数方法动态观测培养细胞干扰组A20-LV-mCD99L2和未经干扰组A20细胞的H/RS样细胞(直径≥25μm)转型率,以人霍奇金淋巴瘤细胞系L428作为对照;采用流式细胞仪检测细胞周期变化。结果获得了稳定表达LV质粒的单克隆细胞株A20-LV-mCD99L2;免疫荧光标记显示转化细胞CD30(+);流式细胞仪检测A20-LV-mCD99L2细胞CD30阳性率为54.4%;透射电镜观察转化后细胞核增大,可见单核、双核及多核,核仁明显的H/RS样细胞;干扰组H/RS样细胞的转型率明显高于未经干扰组(P<0.01)。两组处于S期的细胞无明显差异,两组细胞均未见凋亡峰。结论mCD99L2基因沉默可诱导小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞转化为H/RS样细胞。

小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因表达检测及真核表达载体构建

目的检测及克隆小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因,构建真核表达载体。方法设计寡核苷酸探针,应用原位分子杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因的mRNA表达,RT-PCR法从A20细胞总RNA中获取mCD99L2 基因含编码区全长cDNA,克隆入T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定并经序列测定;设计含酶切位点的PCR引物,PCR 获取含mCD99L2基因编码区片段,用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切取所需目的片段,利用分子克隆技术与 pcDNA3．1／MycHis C(+)质粒重组,对产生的重组子进行PCR、双酶切鉴定,并经过测序证实。结果原位杂交方法检测 A20细胞中mCD99L2基因mRNA呈阳性表达;RT-PCR法成功获得mCD99L2基因编码区全长cDNA序列,DNA序列测序结果与GenBank提供的已知序列(NM-138309)比较,结果完全一致;重组质粒pcDNA3．1-mCD99L2中的插入片段经DNA测序后与GenBank中mD99L2基因相应序列比较,100％同源。结论小鼠B淋巴瘤A20细胞株存在 mCD99L2基因,采用RT-PCR和T-A技术克隆了A20细胞的mCD99L2基因,成功构建了pcDNA3．1-mCD99L2真核表达载体,为下一步探索mCD99L2基因在小鼠B淋巴瘤A20细胞株中的功能奠定了实验基础。

不同方式转染小鼠B淋巴瘤细胞A20的探讨

目的:探讨小鼠B淋巴瘤细胞A20最佳的转染方式,为后期研究LMP1基因在A20细胞中的表达及作用奠定基础。方法:分别使用脂质体转染法、NucleofectorTM核酸转染法和慢病毒载体介导转染法将带有报告基因绿色荧光蛋白的重组质粒pCDF-LMP1转染小鼠B淋巴瘤细胞A20,荧光显微镜观察细胞内绿色荧光的分布,比较分析这三种转染方式对A20细胞的转染效率。结果:脂质体转染效率最低,仅见个别细胞有绿色荧光,NucleofectorTM核酸转染效率约为10%,浓缩后的慢病毒载体介导转染法效率最高,可达80%以上。结论:对于悬浮细胞A20而言,浓缩后的慢病毒载体介导的转染法是最佳的转染方式,该方法在将外源基因转染至悬浮细胞方面值得推广,也为极难转染的细胞做稳定转染提供参考价值。

荧光素酶标记A20鼠B细胞淋巴瘤移植模型的建立

目的:建立荧光素酶标记A20鼠B细胞淋巴瘤移植模型,为后期异基因造血干细胞移植中移植物抗肿瘤作用的研究提供实验工具。方法:将萤火虫荧光素酶作为标记基因导入A20鼠B细胞淋巴瘤细胞株,建立稳定表达荧光素酶的A20细胞株;将其与C57BL/6小鼠骨髓经尾静脉共同接种于辐射后的BALB/c小鼠体内,建立移植肿瘤模型;用活体荧光成像系统检测肿瘤的发生发展,并观察小鼠的活存,体重变化以及成瘤部位;取肿瘤组织和动物脏器行石蜡包埋、病理切片、HE染色观察其组织学特点。结果:经慢病毒转染和嘌呤霉素筛选获得了稳定表达荧光素酶基因的A20细胞株。活体荧光成像观察发现,在A20细胞接种第8天,即可观察到肿瘤发光,随着观察天数的增加荧光强度增强。相比较于骨髓移植(BMT)组,BMT+A2 0-Luc^+组小鼠存活率下降,体重降低明显。大体解剖显示,成瘤部位主要波及肝脏和脾脏,成瘤组织特征类似人弥漫大B细胞淋巴瘤。结论:成功构建了荧光素酶标记A20鼠B细胞淋巴瘤移植模型,为探讨异基因造血干细胞移植中移植物抗肿瘤作用提供了研究平台。

不同方式构建A20鼠B细胞淋巴瘤动物模型

目的探索多种方式构建A20鼠B细胞淋巴瘤动物模型及不同方式造模成瘤的特征。方法鼠源性B细胞淋巴瘤细胞株A20经皮下、尾静脉、脾脏和腹腔接种于同源BALB/c小鼠或先接种裸鼠成瘤后组织块移植BALB/c小鼠,观察动物成瘤时间、成瘤率、成瘤部位;取肿瘤组织和动物脏器行石蜡包埋、病理切片、HE染色观察其组织学特点。结果BALB/c鼠皮下注2×106组、2×107组和裸鼠瘤组织移植BALB/c小鼠组成瘤率皆为100%,成瘤时间分别为(15.29±3.2)d(、7.0±0.82)d和(6.29±0.49)d。BALB/c小鼠尾静脉注射2×106组、2×107组、脾脏注射组、腹腔注射组成瘤率分别为71.4%、100%、71.4%、14.3%,成瘤时间分别为(76.8±12.0)d、(26.1±7.99)d、(32.6±5.99)d和27 d。尾静脉成瘤部位播及肝脏、脾脏、胰腺、肾脏、食道、胃、肠、肠系膜、脑、淋巴结、骨、子宫、肌肉等多脏器和组织。BALB/c鼠A20成瘤组织学类似人弥漫大B细胞淋巴瘤。结论成功构建A20皮下移植瘤模型、血行播散性模型,为利用有免疫功能动物进行B淋巴瘤相关研究提供了实验平台。

播散性鼠B细胞淋巴瘤动物模型的建立

目的在具有免疫能力的BALB／c小鼠上构建播散性B淋巴瘤动物模型。方法经尾静脉注射鼠源性B细胞淋巴瘤细胞株A20于同源BALB／c小鼠，0～3个月间观察动物成瘤情况；取动物脏器行石蜡包埋、病理切片、HE染色；流式细胞仪检测其CD19的表达。结果尾静脉注射2×10^6、2×10^7细胞于14只BALB／c小鼠，成瘤时间分别为76．8±12．0天和26.1±7．9天；总体成瘤率分别为71.4％（5／7）和100％（7／7）；在肝脏、脾脏、淋巴结、肠、肠系膜、下肢、颈部、子宫和臀部等多脏器成瘤；流式检测瘤组织细胞mCD19表达强阳性。结论运用尾静脉注射方法构建了内脏器官广泛发生的播散性B淋巴瘤BALB／c小鼠动物模型，为进一步进行B淋巴瘤相关研究提供了实验依据。

苯丁酸氮芥对淋巴瘤细胞凋亡信号通路的影响

目的:探讨苯丁酸氮芥对B细胞淋巴瘤细胞株A20细胞是否具有促凋亡效应及其在凋亡信号通路中的具体作用机制。方法:实验组使用终浓度为20μmol/L的苯丁酸氮芥处理A20细胞,对照组使用PBS处理A20细胞。使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡情况,使用Western blot检测淋巴瘤细胞中Active caspase-3、Survivin、NF-κB和p AKT的表达,使用荧光定量PCR检测淋巴瘤细胞中Survivin mRNA的表达。结果:与对照组相比较,苯丁酸氮芥干预组的A20细胞FITC^+/PI^+凋亡细胞的比例显著增高,而Active caspase-3的表达显著上调(t=7. 384,P=0. 000),Survivin mRNA的表达显著降低(t=4. 384,P=0. 000),Survivin蛋白的表达显著降低(t=12. 360,P=0. 000),NF-κB蛋白的表达显著降低(t=5. 462,P=0. 000),p AKT的表达显著降低(t=7. 183,P=0. 000)。结论:苯丁酸氮芥促进淋巴瘤细胞凋亡,其机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路、NF-κB和Survivin的表达有关。

CPP-Id对小鼠树突细胞表面共刺激分子表达的影响

背景与目的:B细胞淋巴瘤的独特型(idiotype,Id)免疫球蛋白可作为肿瘤特异性抗原诱发免疫反应抑制肿瘤的发展。本实验拟探讨小鼠淋巴瘤细胞株A20中Id-CTL表位的存在,了解细胞穿透肽(cell-penetratingpeptide,CPP)负载的Id(CPP-Id)进入树突细胞(dendriticcell,DC)的量,以及在细胞内的分布和进入细胞的时相,同时检测其对DC表面标志表达的影响。方法:用RT-PCR方法扩增A20细胞株的Id抗原CTL(cytotoxicitylymphocyte)表位的基因片段,并测序确定氨基酸的序列;通过流式细胞仪检测CPP-Id与Id进入小鼠DC的量的差异及抗原负载前后的DC表型的表达;共聚焦显微镜观察CPP-Id进入细胞的过程及时间;荧光显微镜观察CPP-Id在细胞内的分布。结果:RT-PCR扩增产物为660bp的片段,测序结果表明A20细胞株的Id抗原CTL表位的基因存在。共聚焦显微镜检测显示CPP-Id能在最初200s内快速进入DC,单纯Id进入DC的量很少。10μmol/L的CPP-Id负载的DC细胞平均荧光强度(MFI)高于单独使用Id组(4.35±0.48vs.1.14±0.33,P<0.005);两者负载的DC表面标记CD80、CD86、CD54及MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子表达均比未成熟DC明显增加。结论:CPP-Id比Id进入小鼠DC的量明显增加,CPP肽可以提高Id抗原进入细胞的效率;CPP-Id体外冲击DC后,可以使DC表面MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子,协同刺激分子CD80、CD86以及粘附分子CD54表达显著增高,有利于活化CTL。

低表达mCD99L2鼠B淋巴瘤细胞亚系的建立及鉴定

目的:建立和鉴定稳定的低表达mCD99L2鼠B淋巴瘤细胞亚系,以探究mCD99L2基因在Hodgkin′s淋巴瘤H/RS细胞形成中的作用。方法:对前期构建的慢病毒质粒稳定干扰的A20-LV-mCD99L2克隆株进行体外培养,分别选择第10、20、30、40代细胞,DNA-PCR检测shRNA干扰载体的整合,RT-PCR及荧光定量PCR检测目的基因mCD99L2的表达水平,倒置显微镜观察A20-LV-mCD99L2细胞的形态变化并进行计数,免疫荧光观察H/RS样大细胞mCD30分子的表达。结果:第10、20、30、40代A20-LV-mCD99L2细胞(1)抽提DNA进行PCR均能检测出shRNA干扰载体稳定整合至A20细胞基因组;(2)RT-PCR及荧光定量PCR检测目的基因mCD99L2均较A20细胞呈低水平表达;(3)各代A20-LV-mCD99L2细胞中均发现有类似人H/RS细胞的大细胞(A20-H/RS);(4)免疫荧光检测H/RS样细胞mCD30呈阳性表达。结论:鉴定和建立了低表达mCD99L2基因的A20细胞亚系,该细胞亚系中存在类似人H/RS细胞的大细胞。

类似人弥漫型大B细胞淋巴瘤小鼠模型的免疫学特征

本研究建立类似人弥漫型大B细胞淋巴瘤的BALB/c小鼠模型并探索其免疫学特征。将鼠源性B淋巴瘤细胞株(A20细胞)接种于同源BALB/c小鼠以建立B细胞淋巴瘤鼠模型。实验分为3组:成瘤小鼠组,未成瘤小鼠组和正常小鼠组(对照组)。用流式细胞术检测肿瘤细胞CD抗原表达及成瘤小鼠、未成瘤小鼠和对照正常小鼠的外周血和脾脏的T/B淋巴细胞亚群比例。结果表明:在成功构建病理学形态类似人弥漫大B细胞淋巴瘤的BALB/c鼠模型肿瘤组织中,检测到CD3、CD4、CD8、CD19、CD30阳性细胞的比例分别为(49.27±23.75)%,(6.07±3.65)%,(51.2±23.1)%,(67.06±16.39)%,(37.93±17.03)%,与接种前A20细胞相比,其CD3和CD8阳性细胞比例显著升高,CD19阳性表达比例显著下降(p<0.05)。成瘤小鼠外周血淋巴细胞亚群阳性表达比例较正常小鼠有显著差异,其CD3和CD4阳性细胞比例显著降低(p<0.05)。未成瘤小鼠脾脏淋巴细胞亚群的阳性表达比例与正常小鼠相比,CD3、CD4、CD8阳性细胞比例降低,而CD19阳性细胞比例升高(p<0.05)。结论:本研究为在有免疫功能的小鼠体内进行B细胞淋巴瘤相关研究提供了免疫相关实验依据。

光动力疗法对小鼠B细胞淋巴瘤的体外和体内抗肿瘤作用

目的从体外和体内两个方面探讨二氢卟吩e6衍生物-Photodithazine作为光敏剂(PS)的光动力疗法(PDT)对B细胞淋巴瘤的抗肿瘤作用。方法对A20细胞处理不同浓度(0.125~1.0μg/ml)光敏剂后照射激光波长为(662±3)nm,照射量为6.25 J/cm2。用水溶性四氮唑(WST-1)法测定各组细胞的增殖;用电子显微镜观察细胞形态学变化;流式细胞术(FACS)检测各组细胞的凋亡率及B细胞特异抗原CD45R的表达情况;建立Balb/c小鼠皮下移植瘤模型,对实验动物进行PDT干预后记录各组的肿瘤生长;用Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达。结果体外PDT治疗24 h后0.50μg/ml浓度以上PDT组的A20细胞生长受到了抑制(P<0.05),48 h后0.25μg/ml浓度组细胞生长较对照组也明显抑制(P<0.01);实施PDT后A20细胞形态有了明显变化,镜下出现凋亡细胞和死亡细胞;建立了皮下移植瘤模型,观察到体外PDT抑制了淋巴瘤动物模型中肿瘤的生长(P<0.05);实施PDT的肿瘤组织中P53、P21及Bax等凋亡相关蛋白表达增加。结论 Photodithazine为光敏剂的PDT治疗在体内和体外对A20淋巴瘤具有抗肿瘤作用。

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

目的构建EB病毒潜伏膜蛋白I(LMP1)基因重组慢病毒载体,并检测其在体外的表达。方法采用DNA重组技术,将LMP1基因克隆到带绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体质粒pCDF中,筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序鉴定重组载体。以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装质粒pFIV-34N、包膜质粒pVSV-G和带目的基因的质粒pCDF-LMP1共同转染到包装细胞293FT细胞内包装病毒,荧光显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组病毒的滴度。将重组慢病毒转染小鼠B淋巴瘤细胞系A20,RT-PCR和Western blotting检测LMP1的表达。结果重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实LMP1基因准确克隆入pCDF的多克隆位点,LMP1序列与GenBank中的数据完全一致。荧光显微镜下观察可见293FT细胞的细胞浆与细胞膜有大量的绿色荧光,重组慢病毒浓缩后滴度为107Tu/ml,慢病毒转染A20细胞的效率>90%。RT-PCR和Western blotting检测A20细胞内有LMP1的表达。结论成功构建了LMP1基因重组慢病毒表达载体,慢病毒可高效转染A20细胞,为后期研究EBV致瘤基因LMP1在淋巴瘤发病机制中的作用奠定基础。

mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞A20生物学特性的影响

目的探究mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞生物学特性的影响。方法采用MTT法和流式细胞仪检测mCD99L2基因沉默前后干扰组A20-LV-mCD99L2和未干扰组A20细胞的增殖率和细胞周期;Transwell法测定两组细胞的体外侵袭能力;采用裸鼠与BALB/c鼠皮下成瘤实验观察比较两组细胞在体内的成瘤时间和成瘤率。结果MTT法显示干扰组A20-LV-mCD99L2增殖率为(0.61±0.12),低于未干扰组增殖率(0.75±0.20),差异有统计学意义(P=0.000);干扰组A20-LV-mCD99L2处于G2期的细胞比例为(10.58±4.97),高于未干扰组(3.33±1.31),差异有统计学意义(P=0.009);Transwell法显示干扰组A20-LV-mCD99L2运动能力较未干扰组下降。裸鼠皮下成瘤时间干扰组(13.33±4.63)d长于未干扰组(9.50±2.90)d,成瘤率均为100%;BALB/c鼠皮下成瘤时间干扰组(10d)长于未干扰组(7.0±0.82)d,成瘤率干扰组为14.3%,显著低于未干扰组(100%),差异有统计学意义(P=0.000)。结论mCD99L2基因沉默可抑制小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞的生物学行为,降低其在体外的增殖能力和运动能力,显著降低其在BALB/c鼠体内的成瘤率。