小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因表达检测及真核表达载体构建

目的检测及克隆小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因,构建真核表达载体。方法设计寡核苷酸探针,应用原位分子杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因的mRNA表达,RT-PCR法从A20细胞总RNA中获取mCD99L2 基因含编码区全长cDNA,克隆入T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定并经序列测定;设计含酶切位点的PCR引物,PCR 获取含mCD99L2基因编码区片段,用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切取所需目的片段,利用分子克隆技术与 pcDNA3．1／MycHis C(+)质粒重组,对产生的重组子进行PCR、双酶切鉴定,并经过测序证实。结果原位杂交方法检测 A20细胞中mCD99L2基因mRNA呈阳性表达;RT-PCR法成功获得mCD99L2基因编码区全长cDNA序列,DNA序列测序结果与GenBank提供的已知序列(NM-138309)比较,结果完全一致;重组质粒pcDNA3．1-mCD99L2中的插入片段经DNA测序后与GenBank中mD99L2基因相应序列比较,100％同源。结论小鼠B淋巴瘤A20细胞株存在 mCD99L2基因,采用RT-PCR和T-A技术克隆了A20细胞的mCD99L2基因,成功构建了pcDNA3．1-mCD99L2真核表达载体,为下一步探索mCD99L2基因在小鼠B淋巴瘤A20细胞株中的功能奠定了实验基础。

低表达mCD99L2鼠B淋巴瘤细胞亚系的建立及鉴定

目的:建立和鉴定稳定的低表达mCD99L2鼠B淋巴瘤细胞亚系,以探究mCD99L2基因在Hodgkin′s淋巴瘤H/RS细胞形成中的作用。方法:对前期构建的慢病毒质粒稳定干扰的A20-LV-mCD99L2克隆株进行体外培养,分别选择第10、20、30、40代细胞,DNA-PCR检测shRNA干扰载体的整合,RT-PCR及荧光定量PCR检测目的基因mCD99L2的表达水平,倒置显微镜观察A20-LV-mCD99L2细胞的形态变化并进行计数,免疫荧光观察H/RS样大细胞mCD30分子的表达。结果:第10、20、30、40代A20-LV-mCD99L2细胞(1)抽提DNA进行PCR均能检测出shRNA干扰载体稳定整合至A20细胞基因组;(2)RT-PCR及荧光定量PCR检测目的基因mCD99L2均较A20细胞呈低水平表达;(3)各代A20-LV-mCD99L2细胞中均发现有类似人H/RS细胞的大细胞(A20-H/RS);(4)免疫荧光检测H/RS样细胞mCD30呈阳性表达。结论:鉴定和建立了低表达mCD99L2基因的A20细胞亚系,该细胞亚系中存在类似人H/RS细胞的大细胞。

mic2/CD99基因克隆及在霍奇金淋巴瘤L428细胞株中表达

目的克隆mic2/CD99基因并表达于L428细胞株。方法通过PCR及双酶切方法,从Jurkat细胞基因组RNA中获得mic2/CD99全长基因编码序列,克隆到pcDNA3.1(+)质粒载体上,构建包含mic2/CD99全长基因载体;用脂质体转染法将mic2/CD99全长基因载体转染至L428细胞系;并从分子水平验证其存在。结果RT-PCR方法扩增出大小为558bp片段,序列测定其编码序列正确,酶切鉴定亚克隆序列正确。结论成功构建了mic2/CD99全长基因载体,并稳定转染于L428细胞株中。

cd99l2基因调控斑马鱼白细胞组织间的迁移机制

白细胞在个体发育、组织再生、先天及适应性免疫过程中都发挥了重要作用,而白细胞迁移至感染或创伤区域是其发挥免疫应答功能的必要条件。CD99L2作为黏附分子在白细胞外渗过程中发挥了重要作用,但其是否参与白细胞组织间的迁移尚不明确。本研究通过TALEN技术敲除斑马鱼(Daniorerio)cd99l2基因,发现cd99l2基因缺失后并不影响斑马鱼正常发育。尾鳍损伤后,cd99l2基因突变体在创伤组织处募集的中性粒细胞与巨噬细胞数目显著减少,进一步研究发现mfap4在cd99l2基因突变体中表达显著降低,这可能是影响巨噬细胞向损伤组织处迁移的原因之一。通过标记血管内皮细胞与中性粒细胞及巨噬细胞的转基因斑马鱼品系,发现受精后60h野生型或突变体斑马鱼中性粒细胞和巨噬细胞通过组织间迁移至创伤组织处,表明cd99l2基因参与了白细胞在组织间的迁移。利用RNA-seq分析发现,cd99l2基因突变体中RNA转录、蛋白质折叠及p450通路等被富集。黏附分子调控转录过程及信号传递在以往研究中已被多次证实。据此,本研究推测Cd99l2作为黏附分子参与了白细胞迁移过程中的级联信号通路。综上所述,本研究通过对斑马鱼的研究,发现了cd99l2基因在白细胞迁移过程中新的作用,有望对炎症免疫异常相关疾病提供理论基础。

RD、Hep-2、L20B细胞用于脊髓灰质炎病毒学监测的实验研究

目的 :观察 RD、Hep- 2和 L 2 0 B用于脊髓灰质炎病毒学常规监测的实验结果 ,提高脊髓灰质炎病毒的检出率。方法:对 RD、Hep- 2和 L2 0 B用于脊髓灰质炎病毒监测进行了实验研究。用细胞培养法进行病毒分离。结果 :L2 0 B细胞对脊髓灰质炎病毒具有较强的敏感性和特异性 ,但非脊髓灰质炎肠道病毒 (NPEV)在 RD细胞上呈选择性增值 ,可能会造成 NPEV检出率下降。 结论:RD、Hep- 2和 L2 0

白细胞介素21和CC趋化因子配体20在扁平苔藓皮损中的表达及意义

扁平苔藓（1ichen planus，LP）是一种临床常见的慢性炎症性疾病，常累及皮肤、黏膜等，发病机制目前尚不明确。近年来研究认为T淋巴细胞介导的免疫功能紊乱与LP的发病密切相关，其中辅助性T淋巴细胞（Th）发挥着重要的作用。白细胞介素21（IL-21）是Thl7细胞分泌的特征性因子之一。在包括特应性皮炎和银屑病等多种皮肤病中发挥重要作用。

SP600125对人宫颈癌HeLa细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨SP600125对人宫颈癌HeLa细胞的增殖周期、凋亡以及侵袭的影响。方法采用CCK-8法检测不同时间点不同浓度的SP600125作用后HeLa细胞的增殖状态。确定20μmol/L的SP600125用于后续实验。利用平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,DAPI染色观察细胞核形态,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,细胞划痕和Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力,qRT-PCR和Western blot分别检测SP600125作用不同时间点后各组细胞的p53、Mad2L1和CDC20 mRNA和蛋白水平的变化。结果与对照组(0.1%DMSO)相比,10、20、30、40、50μmol/L SP600125作用24 h均能使细胞的增殖活性降低。与对照组相比,各SP600125处理组的细胞凋亡率明显增加,且G_(2)/M期细胞比例增加(P<0.001),而SP600125处理HeLa细胞24和48 h的G_(0)/G_(1)期比例减少(P<0.001),其细胞的克隆数、迁移和侵袭能力明显下降(P<0.001);qRT-PCR和Western blot结果显示Mad2L1 mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05),p53和CDC20 mRNA和蛋白则呈上升趋势(P<0.01)。结论SP600125可通过上调p53和CDC20以及下调Mad2L1的表达诱导宫颈癌HeLa细胞周期阻滞于G_(2)/M期并促进细胞凋亡来抑制细胞的增殖、迁移和侵袭。

mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞A20生物学特性的影响

目的探究mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞生物学特性的影响。方法采用MTT法和流式细胞仪检测mCD99L2基因沉默前后干扰组A20-LV-mCD99L2和未干扰组A20细胞的增殖率和细胞周期;Transwell法测定两组细胞的体外侵袭能力;采用裸鼠与BALB/c鼠皮下成瘤实验观察比较两组细胞在体内的成瘤时间和成瘤率。结果MTT法显示干扰组A20-LV-mCD99L2增殖率为(0.61±0.12),低于未干扰组增殖率(0.75±0.20),差异有统计学意义(P=0.000);干扰组A20-LV-mCD99L2处于G2期的细胞比例为(10.58±4.97),高于未干扰组(3.33±1.31),差异有统计学意义(P=0.009);Transwell法显示干扰组A20-LV-mCD99L2运动能力较未干扰组下降。裸鼠皮下成瘤时间干扰组(13.33±4.63)d长于未干扰组(9.50±2.90)d,成瘤率均为100%;BALB/c鼠皮下成瘤时间干扰组(10d)长于未干扰组(7.0±0.82)d,成瘤率干扰组为14.3%,显著低于未干扰组(100%),差异有统计学意义(P=0.000)。结论mCD99L2基因沉默可抑制小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞的生物学行为,降低其在体外的增殖能力和运动能力,显著降低其在BALB/c鼠体内的成瘤率。

鼻咽癌外泌体miR-20a通过靶向BCL2L11基因抑制肿瘤相关巨噬细胞凋亡

目的探索鼻咽癌外泌体microRNA是否通过靶向凋亡基因而抑制肿瘤相关巨噬细胞(TAM)凋亡。方法通过生物信息学方法确定目标microRNA及其靶基因,检测鼻咽癌患者血清及鼻咽癌细胞培养基中的外泌体内miR-20a的表达量。应用miR-20a的拟似物及抑制物转染巨噬细胞;并检测干预后的凋亡指数及凋亡通路相关蛋白。结果 miR-20a在鼻咽癌外泌体中表达显著上调。miR-20a的靶基因为BCL2L11,过表达miR-20a可以抑制巨噬细胞凋亡,且凋亡通路相关蛋白Bim、caspase-9和caspase-3均显著减少(P<0.05)。结论miR-20a通过抑制Bim-caspase-9-caspase-3凋亡途径的活化从而抑制鼻咽癌中TAM凋亡。

^(99m)Tc-MIBI检测肺癌耐药性的作用研究

目的拟探讨99mTcMIBI能否检测肺腺癌A549DDP细胞的耐药性及人参单体Rh2作用后A549DDP细胞对顺铂耐药性的变化。方法用MTT法检测顺铂对敏感A549细胞和耐药A549DDP细胞的IC50、对A549DDP细胞的低效浓度(≤IC20),Rh2对A549DDP细胞的无毒浓度(≤IC5)。以无毒浓度Rh2和低效浓度的顺铂联合作用于A549DDP细胞,检测Rh2对顺铂抑制A549DDP细胞的影响。以无毒浓度的Rh2单独作用于A549DDP细胞作为Rh2组,以低效浓度的顺铂单独作用于A549DDP细胞作为DDP组,以无毒浓度的Rh2和低效浓度的顺铂联合作用于A549DDP细胞作为Rh2+DDP组,以不加药物干预作为对照组,Hoechst33258染色荧光显微镜下观察细胞形态的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡峰。γ计数器检测以上4组细胞及A549细胞的放射性活性。将以上细胞注入裸鼠皮下建模后,用99mTcMIBI进行SPECT显像。结果順铂对A549细胞、A549DDP细胞的IC50分别为24、325μmol/L,耐药指数为13.54。Rh2≤10μmol/L时,对A549DDP细胞无明显毒性作用;100μmol/L顺铂对A549DDP细胞的抑制率为12%。10μmol/LRh2与100μmol/L顺铂联合作用,顺铂对A549DDP细胞的IC50降为94μmol/L,与100μmol/L顺铂单独作用于A549DDP细胞的IC50比,逆转3.5倍。荧光显微镜下,Rh2组和DDP组的大部分细胞核和对照组的一样,荧光分布均匀;Rh2+DDP组的荧光成团块分布,有凋亡小体形成。对照组、Rh2组和DDP组的细胞无明显凋亡峰,而Rh2+DDP组则出现了显著的凋亡峰。各组A549DDP细胞和A549细胞均能摄取99mTcMIBI,Rh2组和DDP组与对照组之间细胞的放射性活性差异无统计学意义,而Rh2+DDP组则较对照组细胞的放射性活性显著性降低,P<0.05。A549细胞的放射性活性显著性高于A549DDP细胞的对照组,P<0.01。99mTcMIBI显像,A549组裸鼠可见瘤块的放射性浓聚影。A549DDP对照组和DDP组裸鼠亦可见瘤块的放射性浓聚影,其放射性浓度较A549组淡,这两组间的R或R′差异无统计学意义,但与A549组比较,P<0.05。DDP+Rh2组裸鼠无肿瘤生长,局部未见明显放射性浓聚影。结论99mTc-MIBI能检测肺腺癌耐药的A549DDP细胞的耐药性;无毒浓度的Rh2能有效逆转A549DDP细胞对顺铂的耐药性,这种耐药性的变化亦能被99mTc-MIBI有效检测。

三种细胞在脊髓灰质炎病毒检测中的应用比较

为了比较在常规应用条件下L2 0B细胞与RD、Hep 2细胞对脊髓灰质炎 (脊灰 )病毒 (PV)的敏感性和选择性 ,同时用 3种细胞检测急性弛缓性麻痹 (AFP)病例 412份粪便标本 ,进行PV分离鉴定及效价测定。结果表明 ,L2 0B细胞对PV更敏感 ,对PV有完全的选择性和良好的特异性 ,对同时混有非脊灰肠道病毒 (NPEV)和PV的粪便标本 ,L2 0B细胞能更快地检测出PV ,而RD、Hep 2细胞被NPEV的生长所掩盖。L2 0B细胞的PV检出率 (5 34 % )高于RD(4 6 1% )、Hep 2细胞 (2 6 7% )。L2 0B、RD、Hep 2细胞对PV的敏感性分别为 88%、76 %、44 % ,但 3种细胞对PV都出现了不同程度的漏检。从 2 5株PV效价滴定结果分析 ,3种细胞对PV的滴度均为L2 0B、RD细胞高于Hep 2细胞。表明L2 0B细胞能简化粪便标本PV检测过程。它的应用对PV分离不失为一种便捷、省时、省力、经济和可靠的方法。

电针足三里对严重烫伤致大鼠急性肺损伤的影响

目的 探讨电针足三里对严重烫伤致大鼠急性肺损伤的影响.方法 雄性SD大鼠40只,体重200～250 g,随机分为5组（n=8）：对照组、烫伤组、足三里组、非经非穴组和α-银环蛇毒素组（α-BGT组）.对照组尾静脉注射生理盐水1 ml.烫伤组、足三里组、非经非穴组和α-BGT组先制备30%总体表面积Ⅲ度烫伤模型,然后烫伤组尾静脉注射生理盐水1 ml;足三里组于双侧足三里穴垂直进针7 mm,给予脉冲电流（电压3V,电流2ms,频率3 Hz）持续刺激12 mim,间隔8 h刺激1次,持续2 d;非经非穴组于双侧足三里穴旁5mm处给予脉冲刺激,方法同足三里组;α-BGT组尾静脉注射α-BGT 1.0 μg/kg,再于双侧足三里穴给予脉冲刺激,方法同足三里组.各组处理结束后,处死大鼠,取肺组织,光镜下观察病理学结果,电镜下观察超微结构,采用ELISA法测定肺组织高迁移率族蛋白B1（HMGBl）含量,采用免疫组化法测定HMGBl蛋白表达,采用RT-PCR法测定HMGBl mRNA表达.结果 烫伤组肺组织光镜下可见肺泡壁崩解,泡内大量渗出液,间质水肿、肥厚和增生,伴大量炎性细胞浸润;电镜下可见细胞核形态不规则,核膜僵硬,部分凸凹不平和核溶解,胞质内板层小体明显减少,肺组织病理损伤程度较对照组减轻.与对照组比较,烫伤组、非经非穴组和α-BGT组肺组织HMGBl含量升高,HMGBl蛋白及其mRNA的表达上调（P〈0.05）,足三里组各指标差异无统计学意义（P〉0.05）;与烫伤组比较,足三里组肺组织HMGBl含量降低,HMGBl蛋白及其mRNA的表达下调,非经非穴组和α-BGT组肺组织HMGBl mRNA表达下调（P〈0.05）;与足三里组比较,非经非穴组和α-BGT组肺组织HMGBl含量升高,HMGBl蛋白及其mRNA的表达上调（P〈0.05）.结论 电针足三里可减轻严重烫伤致大鼠急性肺损伤,其机制与激活含α7亚基N型胆碱能受体介导的胆碱能抗炎通路,抑制肺组织HMGBl的表达有关.