ABO血型A201等位基因表达A抗原活性的分析

目的研究ABO血型A201等位基因表达A抗原活性。方法运用血型血清学方法对1家2代3人的唾液及血液标本的ABO血型进行检测;运用Identifiler法医基因分析试剂盒作为亲缘关系鉴定;PCR扩增ABO基因后,对所有外显子做DNA测序分析,运用PCR-RFLP法进行同步检测A201等位基因中的序列变异。结果亲缘关系鉴定在Identifiler的15个遗传标记系统中显示,父母可以将所有的等位基因提供给子女,确定具有亲缘关系;然而运用不同来源的3份抗体对ABO血型进行检验时,却出现了正定型否定了母子关系,反定型无法排除母子关系的现象。3个标本ABO基因的测序:父、母、子的基因型分别为O01/O01、A201/B101及A201/O01,符合反定型结果,这就说明A201等位基因在A表型及AB表型中表达的A抗原活性差异显著。运用PCR-RFLP法可将A201等位基因中的2个主要变异点1059-1061del C和467C/T。结论 ABO血型A201基因在AB及A表型中表达A抗原活性,可由于检测抗体不同出现一定的差异;基因测序与PCR-RFLP法进行同步分析能够快速简便的鉴定A201等位基因中的1059-1061del C和467C/T。

ABO血型A201等位基因表达A抗原活性的分析

目的了解ABO血型系统中A201等位基因表达的A抗原活性。方法采用血型血清学方法检测1个家系2代3人血液和唾液各1份标本的ABO血型表型;应用Identifiler法医基因分析试剂盒作亲缘关系鉴定;PCR扩增ABO基因所有外显子区后作DNA测序分析,PCR-RFLP法同步检测A201等位基因中的序列变异。结果亲缘关系鉴定显示在Identifiler的15个遗传标记系统中,父母均能够提供全部相应的等位基因给孩子,确定存在亲缘关系;然而采用不同来源的3份抗体作ABO血型检验时,出现其中之一的正定型试验否定母子关系、反定型不能排除母子关系的矛盾现象。3个标本ABO基因的测序:父、母、子的基因型分别为O01/O01、A201/B101和A201/O01,支持反定型结果,提示A201等位基因在AB和A表型中所表达的A抗原活性存在明显的差异。PCR-RFLP法成功地同步鉴定出A201等位基因中的2个主要变异点467C/T和1059-1061delC。结论 ABO血型A201基因在AB和A表型中表达A抗原活性可能因检测抗体不同表现出一定的差异;基因测序与PCR-RFLP法同步分析可简便快速地鉴定A201等位基因中的467C/T和1059-1061delC。

花生ahFAD2A等位基因表达变异与种子油酸积累关系

花生ahFAD2A是控制种子油酸、亚油酸含量和油亚比的关键基因。利用ahFAD2A基因特异引物检测远杂9102、豫花9416等52个花生品种的ahFAD2A基因等位变异,并比较其中13个品种的ahFAD2A基因序列。结果表明,花生ahFAD2A基因存在G-A两种单核苷酸等位变异(野生型ahFAD2A-wt和突变体ahFAD2A-m)。DNA序列比对结果证实,豫花9416等10个品种(突变体)与远杂9102、延津花籽和开农白2号(野生型)相比,在ahFAD2A基因的448bp处存在核苷酸G-A突变。应用real-timePCR检测ahFAD2A等位基因在种子不同发育时期的表达动态显示,突变体豫花9416等位基因(ahFAD2A-m)在种子发育中期表达量稍高,种子发育后期表达量下降速度较野生型远杂9102(ahFAD2A-wt)更快。进一步测定豫花9416和远杂9102在种子不同发育时期的油酸、亚油酸积累和油亚比动态,发现2个品种间存在明显差异,豫花9416在籽粒发育前期油酸相对含量已超过亚油酸,油亚比大于1并逐渐增加,而远杂9102到籽粒发育中后期油酸相对含量才高于亚油酸,油亚比逐渐接近于1左右。

人载脂蛋白Eε3等位基因的克隆及表达

目的:克隆人载脂蛋白E(Apolipoprotein E,APOE)ε3等位基因,测定序列,并构建带有人源性APOEε3等位基因的真核表达载体。方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从人胎儿脑组织中克隆得到APOEε3等位基因,与PMD19-T载体连接,再酶切PMD19-T-APOEε3,获得APOEε3基因,然后将其与表达载体pEGFP-N1连接,构建pEGFP-N1-APOEε3真核表达载体。重组质粒转染293T细胞后,在荧光显微镜下观察EGFP的表达,并用Western-Blot的方法检测目的蛋白在293T细胞中的表达。结果:经酶切和DNA测序证明APOEε3基因序列正确,真核表达载体构建成功。将重组质粒转染293T细胞,在转染后的细胞中检测到目的蛋白的表达。结论:成功构建了pEGFP-N1-APOEε3真核表达载体,该表达载体能在真核细胞中正确表达。

新等位基因人类白细胞抗原B*15:133的鉴定及其原核表达

背景:国际上至2010-04共报告人类白细胞抗原4633个等位基因,中国自2000年至少发现200个新的等位基因,由于资金和时间有限,大部分新等位基因未作血清分型、家系研究以及进一步的功能性研究。目的:在健康志愿者人群中发现新等位基因,并对其进行家系研究,同时构建重链胞外区多肽的原核细胞表达载体,鉴定其在原核细胞中是否表达。方法:利用PCR-SSO和PCR-SBT技术,对人群的人类白细胞抗原进行筛选。使用血清学和SBT技术对拥有新等位基因的供者进行家系分析。用分子克隆的方法构建表达载体转染原核细胞,运用Western-blot鉴定是否表达。结果与结论:发现一个新等位基因与人类白细胞抗原B*15:18:01在第419位相差一个核苷酸,C->T,即Codon116位TCC->TTC,导致氨基酸由丝氨酸改变成苯丙氨酸。最终确定命名为人类白细胞抗原B*15:133。血清学表达B71(70)抗原。发现此供者的新等位基因来自于母亲。表达载体pET30a(+)-B*15:133在原核细胞中表达的多肽可被抗HIS标签单克隆抗体特异性识别。结果表明,使用分子生物学技术在大样本的筛查下发现了新等位基因人类白细胞抗原B*15:133,利用分子克隆的方法成功构建表达载体pET30a(+)-B*15:133,并在原核细胞中有大量高纯度蛋白表达。

乳蛋白位点等位基因表达特点的研究

本研究利用聚丙烯酸胺凝胶电泳，结合区带的相对含量扫描测定分析了乳蛋白位点杂合子奶牛乳样基因型，探讨乳蛋白基因的蛋白质表达特点。结果表明，各乳蛋白位点等位基因的蛋白质表达均有显著的不平衡性。αs1－CNB，C，β－LGA，B，κ－CNA，B相对含量间的差异达显著水平。β－CN位点各多位基因表达的蛋白质含量间差异不显著．

利用变性高效液相色谱(dHPLC)进行小麦等位基因差异表达分析

等位基因变异是生物体基因组中普遍存在的现象,也是物种进化和育种的重要基础.等位基因可以通过编码区的改变或者表达来影响基因的功能,因此研究等位基因的表达具有重要的生物学意义.由于小麦基因组的复杂性,造成等位基因的鉴定比较困难,这极大地制约了小麦等位基因表达研究的开展.利用CAU36和CAU328两个EST-SSR标记,结合变性高效液相色谱(dHPLC)分析技术,在35个小麦基因型中分别检测到4种和3种等位变异类型,并且以抽穗期的穗下节节间为材料,对其在4×6的小麦双列杂交组合杂交F1代中进行了表达分析.结果表明,这两个EST-SSR引物扩增的等位基因在多个组合中均存在显著的差异表达,且CAU36标记检测到的等位基因表达变化值与部分杂交种的株高之间存在显著的相关性.

在中国汉族人中发现新不表达等位基因HLA—A^＊0253N

目的 鉴定在中国浙江一个汉族家庭中发现的新的HLA新不表达等位基因。方法 对 1个无γ球蛋白血症患儿及其母作HLA血清学分型与基因分型 ,针对二者结果有差异 (血清学不能检出其中的 1个抗原 ,而DNA基因分型结果为HLA 0 2XX) ,进行基因克隆和基因组DNA全长测序 ,分析该HLA 0 2XX和HLA A 0 2 0 11基因序列差异。结果 该基因与HLA A 0 2 0 11的差异 ,仅在外显子 2区域的 32 4C >G的单个碱基的替换 ,导致了密码子 10 8由酪氨酸变为终止密码子。家系调查表明 ,在被检测的 2 2个家庭成员中 ,患儿及其母亲、外祖父、姐姐和舅舅携带有该基因。而在 718名具有A 0 2基因的随机造血干细胞供者中 ,未发现带有该基因的个体。结论 该基因是 1个HLA A不表达等位基因 ,世界卫生组织 (WHO)基因命名委员会于 2 0 0 1年 9月将其正式命名为HLA A 0 2 5 3N ,其单倍型为A 0 2 5 3N ,B 370 1,DRB1 10 0 1。

高频等位基因HLA-A* 1101重链胞外域-BSP融合蛋白原核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建HLA-A*1101重链胞外域羧基端融合生物素化酶B irA底物肽(BSP)的融合蛋白(HLA-A11-BSP)原核表达载体,并在大肠杆菌中表达该融合蛋白。方法:以RT-PCR法扩增并克隆HLA-A*1101重链基因的cDNA,以PCR方法构建HLA-A11-BSP的表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以免疫印迹法进行鉴定。结果:从HLA-A2阴性的供者外周血单个核细胞中克隆到HLA-A*1101重链基因的cDNA,以此cDNA为模板,将编码HLA-A*1101重链胞外域1~276序列与编码BSP的序列融合,构建HLA-A11-BSP融合蛋白表达载体,重组质粒经测序验证。融合蛋白在BL21(DE3)中诱导后获得高效表达,约占菌体总蛋白的20%;其相对分子质量约为35 000,与理论值一致。免疫印迹分析显示表达产物主要存在于包涵体中,上清液中几乎无任何产物存在。结论:成功构建表达HLA-A11-BSP融合蛋白的原核表达载体,该融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式获得高水平表达。

等位基因结构变异及差异表达研究进展

等位基因的结构变异及差异表达在多种生物中普遍存在。等位基因差异表达对基因的表达起了很重要的调控作用,并最终可能与生物的表型多态性联系起来。但是,由于问题的复杂性和缺乏有效的技术,等位差异表达与基因表达变化乃至表型变化之间的关系至今没有解决,因此对等位差异表达在各种生物中所起的作用仍然是低估的。本文从等位基因差异表达产生的原因、其生物学意义以及检测方法等方面对目前等位基因结构变异及差异表达的研究进展做一简单介绍。

人脑胶质瘤p16、p15、CDK4基因改变和pRb表达及等位基因谱分析的研究

颅内肿瘤中以胶质瘤最常见,约占43.5%.尽管应用了手术、放疗和化疗等综合疗法,胶质瘤患者的预后仍然很差,绝大部分患者难以避免肿瘤复发,其中胶质母细胞瘤患者术后的平均生存期不到一年.因此,人脑胶质瘤的治疗仍然是神经外科所面临的一大难题.本研究针对临床实践中的这一难点,对脑胶质瘤发生发展的分子生物学和分子遗传学机制进行了探索,共包括两大部分内容.

水稻Ef7基因的一个新等位基因Ef7-l的遗传效应及表达分析

水稻Ef7基因控制抽穗期。本研究从我国籼稻品种龙特甫中克隆了Ef7的等位基因Ef7-l,序列比对表明,Ef7-l编码序列与日本晴Ef7相比存在5个氨基酸的差异。利用两个等位基因的序列差异,以日本晴为受体构建了含有Ef7-l的近等基因系CL63。CL63在长日照条件下比轮回亲本日本晴延迟抽穗约6 d,但在短日照条件下两者抽穗期无显著差异。田间性状分析显示Ef7-l等位基因在长日照条件下能够使植株茎秆变粗,粒重显著增加,这可能是通过上调OsPHYB的表达水平而延迟水稻抽穗期实现的。

芸芥自交不亲和等位基因及其表达初步研究

在利用芸芥自交不亲和系途径开展育种研究的过程中,为了避免在人工试配组合时,双亲蕾期杂交结籽率较好,但在自然隔离条件下配制杂交种时出现双亲花期交配不亲和的现象,本试验对10份芸芥进行了系内株间和系间的完全双列杂交,同时对自交不亲和基因的表达器官进行了DDRT-PCR扩增研究。结果表明,芸芥1、芸芥3、芸芥5、芸芥6、芸芥8、芸芥9和芸芥13这7份材料系内株间异交和套袋自交的亲和指数均小于1,即表现为不亲和性,说明这些材料属于S等位基因纯合的不亲和系;而芸芥2、芸芥4和芸芥10这三份材料系内株间异交和套袋自交时,呈现出不亲和性不稳定的现象,即一部分杂交表现为亲和,另一部分杂交表现为不亲和,说明这3份材料的自交不亲和性尚未稳定。DDRT-PCR扩增结果表明,芸芥自交不亲和S基因只在柱头组织中表达,其属于组织特异性表达。因此,在利用自交不亲和系途径培育一代杂种时,在农艺学性状和自交不亲和性基本稳定时,有必要进一步测定自交不亲和系S等位基因的纯合性和基因型,这一工作可以有效地指导育种实践。

RhCE抗原弱表达的分子基础与RHCE变异等位基因相关性研究

目的研究血清学检测中弱反应的C、c、E或e抗原的分子生物学基础,分析RHCE基因多态性,为Rh抗原在临床输血医学、遗传学和免疫学等方面的应用提供理论依据。方法在2010～2011年期间,采用2套单克隆抗-C、-c、-E和抗-e试剂,随机选择10373名RHD阳性献血者进一步检测RhCE血清学表型。血清学弱反应(可以确定抗原阳性的弱反应和极弱反应)的C、c、E或e抗原标本,采用多重PCR-SSP技术检测基因银行公布的22个RHCE等位基因,一些特异的RHCE等位基因鉴定需要进行DNA序列分析。

1个新巨胚等位基因的鉴定与表达分析及其性状考察

该研究以‘超2-10’水稻和‘上师大5号’巨胚水稻为材料,分析了2种水稻的胚重、胚与糙米质量比、巨胚性状的遗传,克隆和分析了其巨胚基因（GE）序列,并对巨胚基因进行了表达分析。结果显示：（1）‘上师大5号’的胚重、胚与糙米质量比均极显著大于‘超2-10’,且‘超2-10’的胚重接近或大于一些已报道的巨胚水稻;（2）‘上师大5号’巨胚表型由1对隐性基因控制,并与韩国巨胚稻‘M-2-565-11-3-B（ge）’属于相同的等位基因突变;（3）‘超2-10’、‘上师大5号’和‘M-2-565-11-3-B（ge）’3种水稻各自具有1个新的GE等位基因,它们的突变位点分别位于启动子、启动子及编码链、编码链;（4）‘上师大5号’启动子及编码链都有突变的GE等位基因（gec）,在开花后4~7d的颖果中表达量持续增加,完全不同于只有编码链突变的GE等位基因呈持续下降的表达模式。该研究首次报道了突变在启动子、突变同时发生在启动子及编码链2种新型巨胚等位基因。

一新的B_(var)等位基因(547 G>A)依赖合并遗传ABO等位基因形成的不同表达

背景和目的在韩国作B型献血者遗传分析。材料和方法对6名B3、6名A183共12名B3表型献血者作外显子6和外显子7测序。结果所有B3和6名A1B3献血者的2名均检出一致的序列。4名A183献血者被确定为新的B等位基因-Vvar位于A101／或者A102／Bvar之间。对于1例A1B3供者Bvar等位基因以及其他具有同样基因型及表型的无关系者家系研究结果显示，Bvar/O01为全B-抗原表达的基因。

等位基因特异性表达形成机制及其应用的研究进展

基因作为遗传信息的介质,决定了生物的性状表现。基因序列变异的发生是生物体适应环境变化的必然趋势。在二倍体生物中等位基因是一对控制着相对性状的基因,因此,等位基因特异性表达效应根据细胞类型和发育阶段的不同而变化,表现出不同个体之间的差异。等位基因差异表达对基因的表达起到重要的调控作用,并最终可能与生物的表型多态性联系起来。等位基因特异性表达分析已经在动物研究中得到广泛应用,有助于提高鉴定调控遗传变异的能力。对等位基因特异性表达的形成机制及其应用研究进展进行了综述,以期为进一步揭示等位基因特异性表达的遗传学机制,以及加快其在动物生产中的应用提供理论依据。

苎麻谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因的克隆及其转基因烟草特性

【目的】克隆谷氨酰胺合成酶BnGS2等位基因,分别构建其超量表达载体,并探讨其在转基因烟草中对氮代谢的影响。【方法】依据苎麻转录组unigenes和RT-PCR技术克隆苎麻BnGS2等位基因,利用内切酶TaqⅠ对目的等位基因在中苎1号自交F1和亲本中进行酶切鉴定,并利用生物信息学对基因序列和结构特征进行分析;通过同源重组技术分别构建BnGS2等位基因的超量表达载体,并在农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404的介导下,通过叶盘法将超量表达载体转入烟草中,通过Kan筛选、转化植株基因组DNA PCR验证获得转基因T0植株;利用qRT-PCR分析BnGS2等位基因在转基因T1植株中的相对表达水平,并测定植株叶片中的GS活性、株高、鲜重、可溶蛋白及总氮含量。【结果】首次从苎麻中克隆了一对GS2等位基因,命名为BnGS2-1和BnGS2-2,等位基因序列全长1 340 bp,含有一个1 293 bp的ORF区,编码430个氨基酸残基多肽;等位基因核苷酸序列在11个位点上存在差异,导致编码的多肽在195、382位点上的氨基酸残基存在替换现象(BnGS2-1为脯氨酸和天冬酰胺,BnGS2-2为苏氨酸和丝氨酸);NCBI BLASTP分析表明苎麻BnGS2与Pisum sativum、Vigna radiata、Glycine max、Phaseolus vulgaris、Medicago truncatula具有很近的亲缘关系;构建了能分别超量表达BnGS2-1和BnGS2-2的载体,并获得能分别超量表达BnGS2-1和BnGS2-2转基因烟草植株;与野生型烟草植株相比,超量表达BnGS2等位基因(BnGS2-1和BnGS2-2)都能显著性提高转基因植株叶片GS活性、鲜重和可溶性蛋白的含量,株高和总氮含量也有增加,但没有达到显著性水平。另外,超量表达不同BnGS2等位基因(BnGS2-1和BnGS2-2)的转基因烟草植株,在株高、鲜重、叶片可溶性蛋白及总氮含量上并没有显著性差异。【结论】在烟草中分别超量表达来源苎麻的BnGS2等位基因(BnGS2-1或BnGS2-2)均能显著提高转基因植株的生物产量和氮利用效率,并且所克隆的2个等位基因BnGS2-1和BnGS2-2在功能上并无显著差异。

自交不亲和性芸苔油菜的培育：Ⅱ．在芸苔油菜中甘蓝S-等位基因的表达

本研究的目的是测定B．oleracea S-等位基因在B．napus和B．oleracea中是否具有相似的表达模式，尤其是检测了S-等位基因纯合体和杂合体中自交不亲和性(SI)的表达以及B．napus中5个B．oleracea等位基因的显性关系。了解B．napus中S-等位基因的复杂互作对于利用SI系统来控制该物种的传粉是有必要的。

人肺癌野生型p73基因的过表达与等位基因表达模式研究

目的：p73基因在肺癌与癌旁正常组织中表达水平及等位基因表达模式的研究。方法：采用竞争性定量RT-PCR和PCR-RFLP等方法检测52例肺癌及其癌旁非癌组织中p73基因表达水平及其等位基因表达模式。结果：①通过定量PCR分析，肺癌组织中p73的表达量平均比正常对照组织中高出6倍，表达量存在显著差异(P<0．01)；②在52份肺癌及其癌旁非癌组织中，共有16份为杂合子，均为双等位基因表达(G／C：A／T)；③不同临床病理类型、临床分期的癌组织间p73mRNA的表达无显著差异(P>0．05)，而在不同分化程度肺癌组织p73mRNA的表达存在显著差异(P<0．01)。结论：p73基因以高表达、等位基因激活方式参与肺癌的发生发展。