天然脂糖肽类抗生素A40926的研究进展

A40926是由Nonomuraea sp.ATCC 39727代谢产生的一种天然脂糖肽类抗生素,结构与替考拉宁相似,生物活性显著,是半合成脂糖肽类抗生素dalbavancin的前体。本文跟踪了近年来国际上A40926的研究进展,从A40926的发现及产生菌、抗菌活性及作用机制、前体导向生物合成、结构修饰及临床研究等方面进行了系统阐述。

A40926高产菌株的选育及发酵工艺优化

目的通过菌种选育与发酵工艺优化,提高A40926发酵产量。方法本文采用紫外线和亚硝基胍两种方法诱变,结合抗生素抗性筛选方法,对A40926的产生菌Nonomuraea sp.SIPI-H3020进行诱变选育,并通过工艺优化提高发酵产量。结果筛选得到一株高产突变株Nonomuraea sp.SIPI-H5972,其发酵效价比出发菌株提高了257%。在优化的摇瓶发酵工艺下,突变株SIPI-H5972的发酵效价达到990μg/m L,又提高了153%。通过补料工艺优化,在50L发酵罐中发酵效价为1223μg/m L,比摇瓶发酵提高了23.5%。结论紫外线和亚硝基胍诱变并结合抗生素抗性筛选对提高A40926发酵单位效果明显,补料工艺可以显著提高其产量。

半合成糖肽类抗生素达巴万星前体A40926的生物合成

综述了继替考拉宁之后的第二代半合成糖肽类抗生素达巴万星前体A40926的研究进展,包括其结构、发酵生产、生物合成以及结构修饰。重点阐述了A40926的生物合成基因簇以及合成途径。达巴万星是A40926的半合成化合物,目前处于Ⅲ期临床研究,它具有比万古霉素和替考拉宁更强的生物活性。

达巴万星前体A40926 B_(0)高产菌株的选育及发酵工艺验证

采用ARTP对达巴万星前体A40926 B_(0)(简称B_(0))的产生菌野野村放线菌DB进行诱变育种,筛选获得一株具有稳定遗传的高产突变株DB-119,B_(0)效价比原始菌株提高了194.6%。通过摇瓶碳氮源优化及100 L发酵工艺验证,B0效价达到2863.8 mg/L。结果表明,DB-119遗传稳定,发酵效价高,降低生产成本,具备工业化发酵生产的潜力。

一种A40926高产菌株的高通量筛选策略

为提高糖肽类抗生素A40926的发酵效价,本研究以野野村放线菌(Nonomuraea sp.)HIPI-H01为出发菌株,采用常压室温等离子体诱变系统进行诱变,并选择链霉素及A40926脂肪酸侧链生物合成前体结构类似物乙酸钠为筛选压力,建立抗性筛选模型,以淘汰大部分不符合要求的突变菌株,使有效性状的突变株得以快速筛选出来,提高正突变率。在建立筛选抗性菌株方法的基础上,以抑菌圈筛选法进行初筛,初步筛得抑菌圈较大的168株突变株。结合出发菌株特性,选取24孔板进行复筛,并比较了微孔培养与摇瓶培养的相关性。结果表明,采用微孔板培养与摇瓶培养具有较好的一致性。与摇瓶培养相比,微孔板筛选体系具有效率高、可有效减少操作步骤及物料的使用量等优点。初筛菌株经微孔板复筛、抑菌圈法检测,筛选出24株发酵液抑菌圈较大的菌株,并以HPLC法检测发酵液中A40926效价,获得1株遗传性能稳定的突变株134#,其合成A40926的能力与原始菌株相比提高了17.6%,A40926效价达到809 mg/L。该菌株命名为野野村放线菌HIPI-M134。

糖肽类抗生素A40926B产生菌的培养基优化及菌种选育

以A40926 B产生菌野野村放线菌SIPI-D-30为出发菌株,通过UV诱变及乙酸钠和甘氨酸抗性平板筛选,获得A40926 B产量提高的突变株SIPI-U-157。经优化,确定摇瓶发酵培养基(g/L)为:葡萄糖5.0、麦芽糊精30.0、可溶性淀粉10.0、玉米淀粉30.0、大豆蛋白胨5.0、肉蛋白胨10.0、酵母浸粉5.0、冷榨黄豆饼粉10.0、棉籽饼粉5.0、L-缬氨酸1.0,发酵培养7 d,突变株的A40926 B发酵单位为893 mg/L。该突变株在5 L发酵罐中培养180 h,A40926 B的产量最高为583 mg/L。

糖肽类抗生素A40926高产菌株的选育

糖肽类抗生素A40926产生菌YT-B2126经紫外线和甲磺酸乙酯复合诱变处理,结合抗生素抗性筛选,获得一株高产菌株YT-B2126-G11,其A40926 B0组分摇瓶发酵单位为1.2 g/L,较出发菌株提高了93%,且遗传稳定性良好。在500 L发酵罐上,A40926 B0组分的发酵单位达到1.1 g/L。

中压制备色谱技术分离富集A40926混合物组分和杂质

A40926是糖肽类抗菌药达巴万星的前体,本文采用中压制备色谱(MPLC)技术分离和富集A40926混合物中的单组分和有关杂质。通过优化填料和洗脱方法,确定以聚合物微球SKP-10为填料,以乙醇-水体系为流动相进行梯度洗脱。结果显示,通过此法一次制备能够获取纯度大于95%的组分A_1、B_0,二次制备可以获得纯度大于95%的杂质RS_1、RS_3,并经高效液相色谱串联四极杆-飞行时间质谱(HPLC-QTOF-MS)法确证其结构,与已有文献描述一致。该方法适用于A40926混合物组分和有关杂质的富集,为药物达巴万星的质量研究提供了支持。

雷帕霉素互变异构体的分离和鉴定

目的分离、纯化HPLC图谱中一直伴随着雷帕霉素的异构体(Rap-T)和它的转化产物并鉴定它们的化学结构。方法制备液相色谱仪分离Rap-T及其转化产物;HPLC跟踪分析Rap-T在25℃、50%乙腈-水溶液中不同时间的转化结果 ;对Rap-T及其转化产物进行理化性质和波谱分析。结果 Rap-T是雷帕霉素化学结构上的吡喃环扩展为氧杂环庚烷的化合物,其转化产物的化学结构与雷帕霉素一致;Rap-T与雷帕霉素在25℃、50%乙腈-水溶液中能相互转化。结论 Rap-T是雷帕霉素的互变异构体,二者可以相互转化。

野野村放线菌ATCC 39727的双组份信号转导系统的生物信息学分析

双组份信号转导系统是放线菌中重要的全局调控系统之一,参与细胞形态分化、氮磷代谢、次级代谢产物合成和其他生理代谢过程。本文采用生物信息学方法系统分析了Nonomuraea sp.中双组份信号转导系统(two-component signal transduction system,TCS)的分布、系统分类、结构与功能,初步构建了部分TCS调控网络,旨在揭示Nonomuraea sp.中次级代谢产物合成与TCS之间的关系,为提高糖肽抗生素A40926效价和发现新的潜在生物活性物质奠定基础。