Bcl-2修饰因子过表达及敲减A549稳转细胞株的构建

目的构建Bcl-2修饰因子(BMF)过表达及BMF敲减A549稳转细胞株。方法本研究为实验研究。根据BMF基因序列设计合成特异性引物并扩增目的基因,将其定向连接至经限制性内切酶BstBⅠ/SpeⅠ酶切后的GL159载体上,构建GL159-BMF重组质粒,经过筛选和测序鉴定后的阳性克隆转染293T细胞,包装慢病毒并测定病毒滴度。构建BMF-shRNA,连接到AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE载体上,经鉴定后转染293T细胞,包装慢病毒、测定病毒滴度,最终转染至A549细胞内。采用RT-PCR技术检测A549稳转细胞株BMF mRNA的表达情况。结果重组质粒GL159-BMF及BMF-shRNA在慢病毒的介导下转染至A549细胞内且稳定表达。RT-PCR检测结果表明:BMF过表达组的BMF mRNA表达量显著高于其对照组,差异倍数为986.23±35.47(P<0.001),BMF敲减组的BMF mRNA表达量显著低于其对照组,差异倍数为0.18±0.06(P<0.001)。结论成功构建BMF过表达及敲减A549细胞株,为后续BMF在慢性阻塞性肺疾病细胞凋亡机制中的研究奠定了基础。