抑制14-3-3ζ表达的siRNA及其重组腺相关病毒载体的构建

[目的]通过构建靶向14-3-3ζ的siRNA及其报告基因EGFP的重组腺相关病毒载体,包装出含有目标基因的腺相关病毒。[方法]设计靶向14-3-3ζ的siRNA,插入到psiRNA质粒H1启动子下游,Western-Blot检测siRNA的抑制效果。从psiRNA质粒上扩增H1-si-ζ基因表达单位亚克隆到AAV表达质粒AAV-MCS-EGFP的Mlu1酶切位点,构建重组质粒pAAV-14-3-3ζ-EGFP。重组质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper用磷酸钙法共转染AAV-293细胞制备重组病毒rAAV-14-3-3ζ-EGFP。重组病毒感染HT1080细胞,荧光显微镜检测病毒介导的EGFP表达。[结果]通过酶切鉴定和测序确定重组病毒载体pAAV-14-3-3ζ-EGFP已构建成功。病毒感染的细胞中检测到绿色荧光,表明重组病毒成功包装。[结论]成功包装出重组腺相关病毒AAV-14-3-3ζ-EGFP,为今后利用腺相关病毒载体进行14-3-3ζ相关的体内、外研究提供了试验基础。

腺相关病毒载体工程毒株精细化纯化

【背景】大量制备高纯度的重组腺相关病毒(Recombinant Adeno-Associated Virus,rAAV),是以腺相关病毒(AAV)为投递载体的基因靶向治疗或基因工程药物研发过程中需要解决的重要问题。【目的】利用层析柱法大量纯化质粒和rAAV细胞培养液,以获得高纯度的rAAV颗粒。【方法】对组装rAAV的3种质粒用HiPrep^(TM)10 Sepharose 6FF和HiTrap PlasmidSelect Xtra凝胶层析柱纯化,目的是得到组装AAV的超螺旋质粒DNA,然后对组装rAAV过程中的AAV-293细胞培养方法进行优化,组装成功病毒后,再对收集到的细胞提取液用HiLoadTM10Q和HiLoadTM10SP阴阳离子交换层析柱纯化,最后用纯化浓缩后的rAAV感染HT1080细胞,通过流式细胞仪检测荧光表达细胞数,计算浓缩后活病毒感染滴度。【结果】HiPrep和HiTrap层析柱纯化后得到大量高纯度的超螺旋质粒DNA,组装病毒后,用HiLoad柱纯化获得大量高纯度的rAAV颗粒,通过测定,rAAV基因组滴度达到(2.46±0.37)×10^(12) TCID50/mL (MOI=1.0×10^(4))。【结论】通过一系列精细化组装纯化制备出高纯度、高滴度rAAV病毒颗粒。