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应用CRISPR/Cas9技术建立IGF-ⅡR基因定点整合的SKBR3细胞系
1
作者
马新宇
王潇
曹中伟
《生物技术通讯》
CAS
2020年第3期297-304,共8页
目的:采用CRISPR/Cas9系统建立胰岛素样生长因子受体2(IGF-ⅡR)基因定点整合的SKBR3细胞系,为探究IGF-ⅡR对人表皮生长因子受体2(HER-2)阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性的影响机制提供细胞模型。方法:根据AAVS1基因序列设计并合成6对小...
目的:采用CRISPR/Cas9系统建立胰岛素样生长因子受体2(IGF-ⅡR)基因定点整合的SKBR3细胞系,为探究IGF-ⅡR对人表皮生长因子受体2(HER-2)阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性的影响机制提供细胞模型。方法:根据AAVS1基因序列设计并合成6对小向导RNA(sgRNA),用UCA CRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒分别与pCS载体连接,筛选效率最高的sgRNA构建Cas9/sgRNA表达载体;用Asi SⅠ+Bstz17Ⅰ酶切将IGF-ⅡR片段连入hAAVS1-KI载体,构建IGF-ⅡR打靶载体,Eco RⅠ+ScaⅠ、NcoⅠ、BglⅡ酶切鉴定并测序验证;将Cas9/sgRNA载体和IGF-ⅡR打靶载体电转SKBR3细胞,经嘌呤霉素筛选,PCR鉴定,获得IGF-ⅡR基因定点整合的混合克隆细胞系;采用半固体及有限稀释方式制备单克隆。结果:构建了作用于AAVS1位点靶序列的Cas9/sgRNA载体,sgRNA活性检测显示sgRNA2具有最高效率;构建了作用于AAVS1位点靶序列的Cas9/sgRNA载体,sgRNA活性检测显示sgRNA2较sgRNA1、sgRNA3-6优势显著,具有最高效率;酶切鉴定并测序确认IGF-ⅡR打靶载体构建成功;电转染最佳条件为1200 V、20 ms、2个脉冲;嘌呤霉素最佳筛选浓度为0.5μg/mL;IGF-ⅡR打靶载体及pCS-sgRNA2质粒成功转染HER-2阳性乳腺癌细胞SKBR3,PCR鉴定及测序验证混合克隆片段基因型正确。结论:获得IGF-ⅡR基因在AAVS1位点定点整合的混合克隆细胞系,为进一步探究IGF-ⅡR对HER-2阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性影响的机制奠定了基础。
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关键词
胰岛素样生长因子受体
2
HER-
2
阳性乳腺癌
CRISPR/Cas
9
技术
基因
敲入
aav
S1
下载PDF
职称材料
从运动神经元的TDP-43蛋白表达和ADAR2活性探讨肌萎缩侧索硬化症的发病机制
被引量:
6
2
作者
宋玉
王恒
+2 位作者
潘卫东
刘云
徐萌
《中国临床神经科学》
2014年第3期356-360,共5页
肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是以上下两级运动神经元进行性丢失为特征的神经系统变性疾病,是运动神经元病(MND)中最常见的类型。运动神经元中的病理性TDP-43是ALS的病理特征。此外,散发性ALS运动神经元中作用于RNA的次黄嘌呤腺苷脱氢酶(ADA...
肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是以上下两级运动神经元进行性丢失为特征的神经系统变性疾病,是运动神经元病(MND)中最常见的类型。运动神经元中的病理性TDP-43是ALS的病理特征。此外,散发性ALS运动神经元中作用于RNA的次黄嘌呤腺苷脱氢酶(ADAR2)减少、具有未经编辑Q/R位点的谷氨酸受体2(GluR2)表达增加,α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(AMPAR)属性受影响,Ca2+通透性增加,Ca2+流入胞质增加导致神经元死亡。ALS运动神经元死亡包含病理性TDP-43和ADAR2活性下降,两种病理变化可能在细胞死亡中存在一定联系。ADAR2 mRNA是TDP-43蛋白的靶RNA,TDP-43蛋白在ADAR2的表达中起调节作用。近年来,研究者探讨ALS的基因治疗可能性:动物实验结果提示,外周静脉给予9型腺相关病毒载体(AAV9),可上调鼠运动神经元ADAR2,引发外源性ADAR2在中枢神经元表达,从而有效防治运动功能障碍。运动神经元的获救可能与TDP-43基因的正常表达有关。AAV9介导的ADAR2基因植入可能为ALS的基因治疗提供新的前景。
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关键词
肌萎缩侧索硬化症
α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体
作用于RNA的次黄嘌呤腺苷脱氢酶
TDP-43蛋白
aav9-adar2基因
原文传递
题名
应用CRISPR/Cas9技术建立IGF-ⅡR基因定点整合的SKBR3细胞系
1
作者
马新宇
王潇
曹中伟
机构
内蒙古自治区人民医院甲乳疝外科
内蒙古自治区人民医院科研处
出处
《生物技术通讯》
CAS
2020年第3期297-304,共8页
基金
内蒙古自治区科技计划(201802116)。
文摘
目的:采用CRISPR/Cas9系统建立胰岛素样生长因子受体2(IGF-ⅡR)基因定点整合的SKBR3细胞系,为探究IGF-ⅡR对人表皮生长因子受体2(HER-2)阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性的影响机制提供细胞模型。方法:根据AAVS1基因序列设计并合成6对小向导RNA(sgRNA),用UCA CRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒分别与pCS载体连接,筛选效率最高的sgRNA构建Cas9/sgRNA表达载体;用Asi SⅠ+Bstz17Ⅰ酶切将IGF-ⅡR片段连入hAAVS1-KI载体,构建IGF-ⅡR打靶载体,Eco RⅠ+ScaⅠ、NcoⅠ、BglⅡ酶切鉴定并测序验证;将Cas9/sgRNA载体和IGF-ⅡR打靶载体电转SKBR3细胞,经嘌呤霉素筛选,PCR鉴定,获得IGF-ⅡR基因定点整合的混合克隆细胞系;采用半固体及有限稀释方式制备单克隆。结果:构建了作用于AAVS1位点靶序列的Cas9/sgRNA载体,sgRNA活性检测显示sgRNA2具有最高效率;构建了作用于AAVS1位点靶序列的Cas9/sgRNA载体,sgRNA活性检测显示sgRNA2较sgRNA1、sgRNA3-6优势显著,具有最高效率;酶切鉴定并测序确认IGF-ⅡR打靶载体构建成功;电转染最佳条件为1200 V、20 ms、2个脉冲;嘌呤霉素最佳筛选浓度为0.5μg/mL;IGF-ⅡR打靶载体及pCS-sgRNA2质粒成功转染HER-2阳性乳腺癌细胞SKBR3,PCR鉴定及测序验证混合克隆片段基因型正确。结论:获得IGF-ⅡR基因在AAVS1位点定点整合的混合克隆细胞系,为进一步探究IGF-ⅡR对HER-2阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性影响的机制奠定了基础。
关键词
胰岛素样生长因子受体
2
HER-
2
阳性乳腺癌
CRISPR/Cas
9
技术
基因
敲入
aav
S1
Keywords
insulin-like growth factor receptor
2
HER-
2
positive breast cancer cells
CRISPR/Cas
9
knock-in
aav
S1
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
下载PDF
职称材料
题名
从运动神经元的TDP-43蛋白表达和ADAR2活性探讨肌萎缩侧索硬化症的发病机制
被引量:
6
2
作者
宋玉
王恒
潘卫东
刘云
徐萌
机构
上海中医药大学附属曙光医院神经内科
上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院中医内科
出处
《中国临床神经科学》
2014年第3期356-360,共5页
基金
上海浦江人才计划资助项目(编号:09PJ1409300)
国家自然科学基金面上项目(编号:81373619)
文摘
肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是以上下两级运动神经元进行性丢失为特征的神经系统变性疾病,是运动神经元病(MND)中最常见的类型。运动神经元中的病理性TDP-43是ALS的病理特征。此外,散发性ALS运动神经元中作用于RNA的次黄嘌呤腺苷脱氢酶(ADAR2)减少、具有未经编辑Q/R位点的谷氨酸受体2(GluR2)表达增加,α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(AMPAR)属性受影响,Ca2+通透性增加,Ca2+流入胞质增加导致神经元死亡。ALS运动神经元死亡包含病理性TDP-43和ADAR2活性下降,两种病理变化可能在细胞死亡中存在一定联系。ADAR2 mRNA是TDP-43蛋白的靶RNA,TDP-43蛋白在ADAR2的表达中起调节作用。近年来,研究者探讨ALS的基因治疗可能性:动物实验结果提示,外周静脉给予9型腺相关病毒载体(AAV9),可上调鼠运动神经元ADAR2,引发外源性ADAR2在中枢神经元表达,从而有效防治运动功能障碍。运动神经元的获救可能与TDP-43基因的正常表达有关。AAV9介导的ADAR2基因植入可能为ALS的基因治疗提供新的前景。
关键词
肌萎缩侧索硬化症
α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体
作用于RNA的次黄嘌呤腺苷脱氢酶
TDP-43蛋白
aav9-adar2基因
Keywords
amyotrophic lateral sclerosis
α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate receptor
adenosine dehydrogenase acting on RNA
2
TDP-43 protein
aav
9
-mediated ADAR
2
gene
分类号
R746 [医药卫生—神经病学与精神病学]
原文传递
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
应用CRISPR/Cas9技术建立IGF-ⅡR基因定点整合的SKBR3细胞系
马新宇
王潇
曹中伟
《生物技术通讯》
CAS
2020
0
下载PDF
职称材料
2
从运动神经元的TDP-43蛋白表达和ADAR2活性探讨肌萎缩侧索硬化症的发病机制
宋玉
王恒
潘卫东
刘云
徐萌
《中国临床神经科学》
2014
6
原文传递
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