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Cas9-sgRNA共质粒系统提高在AAVS1位点的打靶效率 被引量:1
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作者 俞珺瑶 李晓兰 +2 位作者 张健萍 程涛 张孝兵 《生物技术通讯》 CAS 2015年第4期449-453,共5页
目的:为进一步提高CRISPR/Cas9系统的打靶效率,比较共质粒或双质粒表达Cas9内切酶和小向导RNA(sg RNA)的不同载体设计对其打靶效率的影响。方法:将针对AAVS1位点的2个sg RNA序列分别插入表达Cas9的质粒p Sp Cas9上,再将其构建为Cas9-sg ... 目的:为进一步提高CRISPR/Cas9系统的打靶效率,比较共质粒或双质粒表达Cas9内切酶和小向导RNA(sg RNA)的不同载体设计对其打靶效率的影响。方法:将针对AAVS1位点的2个sg RNA序列分别插入表达Cas9的质粒p Sp Cas9上,再将其构建为Cas9-sg RNA二合一的共质粒以及独立表达sg RNA和Cas9的双质粒系统;质粒转染293T细胞后,用T7E1酶切方法检测打靶效率。结果:不经过变性退火的PCR片段也能直接进行T7E1酶切;Cas9-sg RNA共质粒系统的打靶效率显著高于双质粒系统。结论:T7E1酶切方法可去除变性退火步骤,简化了传统的检测方法。采用Cas9-sg RNA共表达的载体设计可显著提高打靶效率。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 aavs1位点 T7E1酶切方法 打靶效率
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CRISPR-Cas9基因编辑报道系统应用于AAVS1安全港的定点整合
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作者 曹淳 陈耀 +3 位作者 何佳佳 张毛雪 钱正韬 周小明 《华中科技大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期825-829,共5页
目的利用ZFN与TALEN基因编辑以及同源重组技术将Cas9表达框、基因编辑效率荧光报道系统以及真核细胞筛选标记的DNA超长片段定点插入HEK-293T细胞基因组AAVS1安全港,建立可用于衡量CRISPR-Cas9基因编辑的稳定细胞株。方法利用分子克隆技... 目的利用ZFN与TALEN基因编辑以及同源重组技术将Cas9表达框、基因编辑效率荧光报道系统以及真核细胞筛选标记的DNA超长片段定点插入HEK-293T细胞基因组AAVS1安全港,建立可用于衡量CRISPR-Cas9基因编辑的稳定细胞株。方法利用分子克隆技术构建AAVS1-all-in-one-CRISPR质粒。利用脂质体将识别并切割AAVS1基因组序列的ZFN和TALEN质粒以及AAVS1-all-in-one-CRISPR质粒共转染入HEK-293T细胞。使用嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞后,利用杀稻瘟菌素S筛选、红色荧光检测、Cas9 Western blot以及基因组PCR鉴定等方法获得CRISPR-Cas9基因编辑报道系统完整整合入AAVS1安全港的稳定细胞株。继而,将EGFP修复模板单链DNA及EGFP sgRNA瞬时转染入这些稳定细胞株,对失去荧光的EGFP进行基因编辑,恢复其发光功能,并通过荧光检测技术验证基因编辑结果。结果成功获得3株同时具有嘌呤霉素和杀稻瘟菌素S抗性以及表达红色荧光蛋白的单克隆细胞,Western blot证实其成功表达Cas9蛋白,基因组PCR鉴定目的基因成功整合入基因组AAVS1位点。经EGFP基因编辑后,细胞恢复绿色荧光。结论利用ZFN与TALEN将完整的CRISPR-Cas9基因编辑报道系统成功整合入HEK-293T细胞基因组的AAVS1安全港,整合DNA片段长度达11.5 kb,并利用Cas9成功编辑EGFP报道基因。 展开更多
关键词 aavs1 CRISPR ZFN TALEN 基因编辑
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基于AAVS1位点构建稳定表达Cas9蛋白的非小细胞肺癌细胞系
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作者 方未英 张啸宇 +2 位作者 顾婷玉 陈跃磊 邵婷 《中国细胞生物学学报》 CSCD 2023年第10期1433-1441,共9页
该研究旨在利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术将Cas9基因序列整合入非小细胞肺癌A549细胞基因组中的AAVS1位点,建立稳定表达Cas9蛋白的A549单克隆细胞系。该技术避免了Cas9基因随机整合进入基因组带来的潜在风险。通过PCR、Western blo... 该研究旨在利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术将Cas9基因序列整合入非小细胞肺癌A549细胞基因组中的AAVS1位点,建立稳定表达Cas9蛋白的A549单克隆细胞系。该技术避免了Cas9基因随机整合进入基因组带来的潜在风险。通过PCR、Western blot、CCK-8、STR技术分别检测A549单克隆细胞系的插入位点、Cas9蛋白水平、细胞增殖能力、基因编辑能力以及细胞身份信息。上述结果显示,在单克隆细胞系A549 Cas9-copGFP-1中Cas9基因准确插入至AAVS1安全位点并高表达Cas9蛋白,细胞增殖能力未发生改变。此外,该细胞还具有良好的基因编辑能力,细胞身份信息准确无误。总之,A549 Cas9-copGFP-1细胞可用于进一步的基因编辑,为肺癌相关基因的高通量筛选和功能性研究提供一种有力工具。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 aavs1位点 非小细胞肺癌细胞系
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靶向剪切AAVS1位点CRISPR/Cas9腺病毒系统的构建 被引量:3
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作者 于声 杨玲凤 +4 位作者 姜伯劲 张安文 陈美琳 陈晓丹 段斯亮 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期1355-1360,共6页
本研究拟使用腺病毒介导的CRISPR/Cas9系统靶向剪切AAVS1位点,为实现AAVS1位点基因定点插入奠定基础。设计针对AAVS1位点的gRNA序列,连接到pENTRY-U6-h EF1a-Cas9载体,通过Gateway技术重组到腺病毒骨架质粒pAD,转染293A细胞包装腺病毒... 本研究拟使用腺病毒介导的CRISPR/Cas9系统靶向剪切AAVS1位点,为实现AAVS1位点基因定点插入奠定基础。设计针对AAVS1位点的gRNA序列,连接到pENTRY-U6-h EF1a-Cas9载体,通过Gateway技术重组到腺病毒骨架质粒pAD,转染293A细胞包装腺病毒。腺病毒感染Hela细胞系,使用T7E1酶切及测序检测AAVS1位点的打靶效率。T7EI酶切结果显示腺病毒介导的CRISPR/Cas9系统剪切效率达到28.5%。腺病毒介导的CRISPR/Cas9系统对AAVS1位点成功实施了剪切,为下一步在Hela细胞内进行基因定点敲入及基因治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 aavs1位点 CRISPR-CAS9 基因敲除 腺病毒系统
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Dual-targeting AAV9P1-mediated neuronal reprogramming in a mouse model of traumatic brain injury
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作者 Jingzhou Liu Xin Xin +8 位作者 Jiejie Sun Yueyue Fan Xun Zhou Wei Gong Meiyan Yang Zhiping Li Yuli Wang Yang Yang Chunsheng Gao 《Neural Regeneration Research》 SCIE CAS CSCD 2024年第3期629-635,共7页
Traumatic brain injury results in neuronal loss and glial scar formation.Replenishing neurons and eliminating the consequences of glial scar formation are essential for treating traumatic brain injury.Neuronal reprogr... Traumatic brain injury results in neuronal loss and glial scar formation.Replenishing neurons and eliminating the consequences of glial scar formation are essential for treating traumatic brain injury.Neuronal reprogramming is a promising strategy to convert glial scars to neural tissue.However,previous studies have reported inconsistent results.In this study,an AAV9P1 vector incorporating an astrocyte-targeting P1 peptide and glial fibrillary acidic protein promoter was used to achieve dual-targeting of astrocytes and the glial scar while minimizing off-target effects.The results demonstrate that AAV9P1 provides high selectivity of astrocytes and reactive astrocytes.Moreover,neuronal reprogramming was induced by downregulating the polypyrimidine tract-binding protein 1 gene via systemic administration of AAV9P1 in a mouse model of traumatic brain injury.In summary,this approach provides an improved gene delivery vehicle to study neuronal programming and evidence of its applications for traumatic brain injury. 展开更多
关键词 AAV9P1 ASTROCYTES astrocyte-to-neuron conversion GFAP promoter glial scar induced neurons neuronal reprogramming P1 peptide PTBP1 traumatic brain injury
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应用CRISPR/Cas9技术建立ERK激酶相分离荧光探针定点整合的稳定细胞株
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作者 杨玉梅 张坤晓 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期159-164,共6页
旨在构建人AAVS1位点定点敲入的诱导表达型ERK-SPARK激酶荧光探针的人食管鳞癌细胞株(KYSE-150)。根据AAVS1位点的DNA序列设计和已公开ERK-SPAEK荧光探针碱基序列构建了两端带有750 bp同源臂的诱导型ERK-SPARK表达盒的同源重组供体质粒... 旨在构建人AAVS1位点定点敲入的诱导表达型ERK-SPARK激酶荧光探针的人食管鳞癌细胞株(KYSE-150)。根据AAVS1位点的DNA序列设计和已公开ERK-SPAEK荧光探针碱基序列构建了两端带有750 bp同源臂的诱导型ERK-SPARK表达盒的同源重组供体质粒。其次,利用在线设计工具设计了3个靶向AAVS1位点的sgRNA,并克隆至pX330骨架质粒中得到3个能定点切割AAVS1位点的CRISPR/Cas9打靶载体,将同源重组供体质粒分别与表达CRISPR/Cas9打靶载体共转染KYSE-150细胞,经Dox诱导表达24 h后进行嘌呤霉素抗性筛选和流式细胞分选,得到抵抗嘌呤霉素且表达GFP的细胞亚群。再应用PCR鉴定基因型,以及Western blot检测蛋白表达。对获得的细胞群提取基因组DNA并进行PCR基因型鉴定,结果显示获得片段的大小与诱导型ERK-SPARK表达盒的大小一致。蛋白表达检测结果显示,该细胞群表达了ERK-SPARK探针融合蛋白。荧光探针成像实验结果显示,在未经Dox诱导表达条件下,细胞株有极少量泄漏表达;经Dox诱导表达后,GFP荧光蛋白在细胞质内均匀分布,无明显聚集成点现象;在加入EGF激活ERK激酶后,原本在细胞质内均匀分布的GFP绿色荧光聚集成高亮度的绿色液珠。成功获得了可诱导表达检测ERK激酶活性的SPARK荧光探针的稳定细胞株,解决了瞬时表达ERK-SPARK探针效率不稳定影响实验结果准确性的问题,为后续建立基于SPARK技术的高通量蛋白激酶抑制剂的筛选平台奠定了前期研究基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 aavs1安全港 同源重组 SPARK荧光探针 稳定细胞株 KYSE-150细胞 细胞外调节蛋白激酶 表皮生长因子
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rAAV2-BF增强两品系小鼠抗致死剂量细菌感染
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作者 关翔宇 刘振龙 +3 位作者 吕喆 孔庆利 王炜 安云庆 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2010年第9期918-924,共7页
目的通过观测rAAV2-BPI1-199-Fcγ1重组病毒(rAAV-BF)感染对不同品系小鼠的抗细菌感染保护作用。方法采用dot blot、Western blot、免疫组化、改良ELISA方法和内毒素检测试剂盒,检测重组BPI1-199-Fcγ1(rBF)蛋白在CHO细胞和小鼠骨骼肌... 目的通过观测rAAV2-BPI1-199-Fcγ1重组病毒(rAAV-BF)感染对不同品系小鼠的抗细菌感染保护作用。方法采用dot blot、Western blot、免疫组化、改良ELISA方法和内毒素检测试剂盒,检测重组BPI1-199-Fcγ1(rBF)蛋白在CHO细胞和小鼠骨骼肌细胞中的表达及血清中内毒素含量的变化;建立最小致死量(MLD)E.coli致死模型,检测rBF基因转染小鼠对MLDE.coli感染的抵抗作用。结果(1)rBF蛋白在CHO细胞和两品系小鼠骨骼肌细胞中成功表达,血清中rBF蛋白具有中和内毒素和杀伤E.coli的作用;(2)在MLDE.coli腹腔感染后,两品系小鼠rAAV-BF感染组存活率均显著高于空载体对照组小鼠;基因转染组小鼠血清内毒素含量明显低于空载体对照组;rAAV-BF感染与头孢呋辛钠联合应用具有协同抗菌作用,两品系小鼠存活率明显高于单纯rAAV-BF感染组。结论rAAV-BF感染组小鼠对致死性E.coli感染具有抵抗作用。 展开更多
关键词 AAV2-BPI1-199-Fcγ1重组病毒 BPI1-199-Fcγ1重组蛋白 革兰阴性菌 内毒素 最小致死量
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应用CRISPR/Cas9技术建立IGF-ⅡR基因定点整合的SKBR3细胞系
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作者 马新宇 王潇 曹中伟 《生物技术通讯》 CAS 2020年第3期297-304,共8页
目的:采用CRISPR/Cas9系统建立胰岛素样生长因子受体2(IGF-ⅡR)基因定点整合的SKBR3细胞系,为探究IGF-ⅡR对人表皮生长因子受体2(HER-2)阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性的影响机制提供细胞模型。方法:根据AAVS1基因序列设计并合成6对小... 目的:采用CRISPR/Cas9系统建立胰岛素样生长因子受体2(IGF-ⅡR)基因定点整合的SKBR3细胞系,为探究IGF-ⅡR对人表皮生长因子受体2(HER-2)阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性的影响机制提供细胞模型。方法:根据AAVS1基因序列设计并合成6对小向导RNA(sgRNA),用UCA CRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒分别与pCS载体连接,筛选效率最高的sgRNA构建Cas9/sgRNA表达载体;用Asi SⅠ+Bstz17Ⅰ酶切将IGF-ⅡR片段连入hAAVS1-KI载体,构建IGF-ⅡR打靶载体,Eco RⅠ+ScaⅠ、NcoⅠ、BglⅡ酶切鉴定并测序验证;将Cas9/sgRNA载体和IGF-ⅡR打靶载体电转SKBR3细胞,经嘌呤霉素筛选,PCR鉴定,获得IGF-ⅡR基因定点整合的混合克隆细胞系;采用半固体及有限稀释方式制备单克隆。结果:构建了作用于AAVS1位点靶序列的Cas9/sgRNA载体,sgRNA活性检测显示sgRNA2具有最高效率;构建了作用于AAVS1位点靶序列的Cas9/sgRNA载体,sgRNA活性检测显示sgRNA2较sgRNA1、sgRNA3-6优势显著,具有最高效率;酶切鉴定并测序确认IGF-ⅡR打靶载体构建成功;电转染最佳条件为1200 V、20 ms、2个脉冲;嘌呤霉素最佳筛选浓度为0.5μg/mL;IGF-ⅡR打靶载体及pCS-sgRNA2质粒成功转染HER-2阳性乳腺癌细胞SKBR3,PCR鉴定及测序验证混合克隆片段基因型正确。结论:获得IGF-ⅡR基因在AAVS1位点定点整合的混合克隆细胞系,为进一步探究IGF-ⅡR对HER-2阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性影响的机制奠定了基础。 展开更多
关键词 胰岛素样生长因子受体2 HER-2阳性乳腺癌 CRISPR/Cas9技术 基因敲入 aavs1
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美对台军售:AAV7A1是啥玩艺儿?
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作者 施征 《海洋世界》 2001年第10期17-18,共2页
今年的4月,美国又一次住全世界中国人的愤怒抗议声中,批准向台湾出售了包括AAV7A1型两栖装甲突击车在内的大量先进军事武器。现在就让我们认识一下AAV7A1型两栖装甲突击车吧。结构特征从外形上看,AAV7型与AAV7A1型这两型基本上是一模一... 今年的4月,美国又一次住全世界中国人的愤怒抗议声中,批准向台湾出售了包括AAV7A1型两栖装甲突击车在内的大量先进军事武器。现在就让我们认识一下AAV7A1型两栖装甲突击车吧。结构特征从外形上看,AAV7型与AAV7A1型这两型基本上是一模一样的。 展开更多
关键词 两栖装甲突击车 火力 美国 美利坚合众国 北美洲 AAV7A1 高射机枪 大口径机枪 附加装甲 AI 铝合金装甲 两栖突击车 美海军陆战队 轻武器 常规武器
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雷帕霉素介导的caspase 9同源二聚化调控人类多能干细胞自杀
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作者 杨洋 刘洋 +5 位作者 陈敏 李双鹏 鹿璇 贺瑜 张焜 邹庆剑 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期4098-4107,共10页
人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)在再生医学领域具有广阔的应用前景。然而,多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)具有肿瘤化风险,成为其临床应用最主要的安全性问题。雷帕霉素是一种安全和广泛使用... 人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)在再生医学领域具有广阔的应用前景。然而,多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)具有肿瘤化风险,成为其临床应用最主要的安全性问题。雷帕霉素是一种安全和广泛使用的免疫抑制药物,通过诱导FKBP12与FRB片段的异源二聚起作用。为了保障hiPSCs治疗的安全性,本研究将雷帕霉素诱导的caspase 9(riC9)基因插入到AAVS1安全位点,构建了含有EF1α启动子、FRB-FKBP-Caspase9(CARD结构域)融合蛋白和嘌呤霉素抗性基因的供体,并与sgRNA/Cas9载体共转染hiPSCs。用嘌呤霉素筛选2周后,收集单个克隆进行基因和表型分析。最后,用雷帕霉素诱导caspase9同源二聚化,激活工程细胞的凋亡。通过对筛选获得的5个hiPSCs克隆鉴定,表明供体DNA准确敲入内源性AAVS1位点。hiPSCs保持正常的多潜能状态和增殖能力。雷帕霉素可诱导caspase9同源二聚化,并激活细胞凋亡程序。本研究通过药物精确调控caspase9的同源二聚化来启动细胞自杀,实现了可控的hiPSCs存活,这为保证hiPSCs治疗的安全性提供了新的策略。 展开更多
关键词 诱导多能干细胞 aavs1 caspase 9 雷帕霉素 同源二聚化
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基因治疗药物Alipogene tiparvovec的研究进展 被引量:2
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作者 徐洋 闫荟羽 +1 位作者 陶娌娜 张四喜 《中国药房》 CAS 北大核心 2015年第11期1579-1582,共4页
目的:为其他基因治疗药物的研发提供思路。方法:查阅文献,整理和归纳Alipogene tiparvovec药理学、毒理学、临床有效性和安全性相关研究进展。结果与结论:Alipogene tiparvovec通过腺病毒载体(AVV1)将活性LPL基因(LPLS447X)整合入肌细... 目的:为其他基因治疗药物的研发提供思路。方法:查阅文献,整理和归纳Alipogene tiparvovec药理学、毒理学、临床有效性和安全性相关研究进展。结果与结论:Alipogene tiparvovec通过腺病毒载体(AVV1)将活性LPL基因(LPLS447X)整合入肌细胞脱氧核糖核酸,从而使这些肌细胞能产生正常数量的LPL,真正实现用外源正常基因替代缺陷基因治疗疾病的目的。临床研究显示,一次性肌内注射单剂量本品,可显著降低血液中的甘油三酯和乳糜微粒浓度,临床症状和痛苦明显缓解,腺炎发病率明显下降,可有效治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症及预防其并发症;接受本品治疗的患者目前除局部的肌炎不良反应外,未发现不可耐受的其他严重不良反应。 展开更多
关键词 Alipogene tiparvovec Glybera AAV1-LPLSS47X 药理学 毒理学 临床研究
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日本采购AAV7A1两栖突击车
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作者 曹伟 《国外坦克》 2016年第4期4-4,共1页
2016年4月7日,日本防卫省授予BAE系统公司一份价值1.49亿美元合同,采购30辆新型AAV7A1两栖突击车。该订单将使BAE系统公司重启AAV7A1的生产线。公司称,采购的车辆被称为AAV7A1RAM/RS(可靠性、可用性与可维修性/重建为标准),合同中还... 2016年4月7日,日本防卫省授予BAE系统公司一份价值1.49亿美元合同,采购30辆新型AAV7A1两栖突击车。该订单将使BAE系统公司重启AAV7A1的生产线。公司称,采购的车辆被称为AAV7A1RAM/RS(可靠性、可用性与可维修性/重建为标准),合同中还包括工具和测试设备以及培训设备。 展开更多
关键词 两栖突击车 AAV7A1 培训设备 悬挂系统 可维修性 测试设备 步兵战车 布雷德利 传动系统
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