口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的克隆及3AB基因的原核表达

从感染口蹄疫病毒 (foot- and- m outh disease virus,FMDV)的细胞中提取总 RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT- PCR)获得了长度约为 14 0 0 bp的核酸片段 ,与预期长度相符。扩增产物经克隆后 ,测序证明其含有完整的 3ABC基因。该序列与国外参考序列 0 1K/ 6 6相比 ,同源性在 99%以上。亚克隆 3ABC基因至表达载体 p Tri Ex- 4 Neo中 ,通过序列分析发现 ,克隆到 p Tri Ex- 4 Neo载体上的片段于 3ABC基因 70 9～ 72 5 bp之间有 17bp的缺失 ,碰巧在 3AB基因后形成一终止密码子 ,但 3AB基因的阅读框架完整。选出含有 3AB基因完整阅读框架的阳性克隆 ,用 IPTG诱导表达 ,收集菌液进行 SDS- PAGE电泳、Western blotting分析 ,结果表明 ,3AB基因在大肠杆菌中成功表达 ,其表达产物为分子质量 33.5 ku的融合蛋白 ,并能被口蹄疫病毒阳性血清识别。经薄层扫描分析 ,表达的目的蛋白占总蛋白量的 2 6 %以上。该项研究为应用重组

口蹄疫病毒NSP 3ABC基因在昆虫细胞中的分泌表达及其活性检测

用设计的特异引物,扩增得到了N-端带有6×His编码序列的口蹄疫病毒完整3ABC基因序列,并将其亚克隆入带有蜂毒溶血肽序列的穿梭质粒pMelBac-B中,构建了重组质粒pMel-3ABC。将该重组质粒与杆状病毒骨架DNABac-N-BlueTM共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒。重组病毒感染Sf9昆虫细胞,采用通过SDS-PAGE和Western blot检测,证明目的基因在昆虫细胞中得到了正确的表达,表达产物分泌至细胞培养上清中,并具有良好的生物活性。表达的目的蛋白经过镍柱亲和层析法纯化后,用间接ELISA方法检测与口蹄疫病毒感染动物血清的反应性,证明表达目的蛋白与感染动物血清有很好的反应性而与正常动物以及免疫动物血清不发生反应。该研究为建立一种更加敏感和特异的口蹄疫病毒感染动物与疫苗免疫动物的鉴别诊断方法奠定了基础。

口蹄疫病毒3ABC基因截短体在毕赤酵母中的表达及鉴定

将长为525bp的口蹄疫病毒3ABC基因截短体克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建了重组表达质粒pPIC9K-3ABCt.用BglⅡ线性化后,电转化毕赤酵母菌GS115,经表型筛选,PCR鉴定,获得阳性重组菌(GS115/pPIC9K-3ABCt).然后进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果表明,重组菌株成功分泌表达了分子量为40000,具有免疫反应活性,且呈二聚体形式的目的蛋白.在96h时表达量达到最高峰,占分泌总蛋白的18%,达到23.4mg/L.为进一步研制口蹄疫免疫和感染动物鉴别诊断试剂奠定了基础.

口蹄疫病毒非结构蛋白3abc基因的克隆与表达

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus , FMDV)非结构蛋白(NSP)-3ABC可用于注苗与感染动物的鉴别诊断,合成该基因的PCR引物,并在引物5 端和3 端分别加入含BamH I和Hind III限制性酶切位点序列。以FMDV毒株基因组RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增3abc基因,得到的基因片段与T载体连接,转化DH5α。提取重组载体pT-3ABC,经BamH I/Hind III双酶切后与载体pET32a连接,转化宿主菌BL21(DE3)plysS,IPTG诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE及Western Blotting检测和鉴定结果表明,在大肠杆菌中成功表达了NSP-3ABC蛋白,分子量约56kDa,且该表达产物可与FMDV感染的动物血清产生免疫反应。ELISA试验结果显示,表达蛋白可用于FMDV注苗与感染动物的鉴别诊断。

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的原核表达及其产物的活性检测

利用分别带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增出FMDV 3ABC基因,将其克隆到pMD18-T载体。经BamHⅠ和SalⅠ酶消化后,克隆到表达载体pGEX-6p-1上,构建重组质粒pGEX-3ABC。将该重组质粒转化到大肠埃希氏菌BL21(DE3)pLysS,经终浓度1 mmol/L的IPTG诱导,获得约70 ku的融合蛋白GST-3ABC。Western-blotting结果显示,表达的融合蛋白GST-3ABC可以与感染FMDV的牛血清发生免疫反应。以纯化的GST-3ABC蛋白为抗原的间接ELISA检测结果与以VP2蛋白为抗原的间接ELISA检测结果相比较,表明,融合蛋白GST-3ABC可以用于鉴别感染FMDV和疫苗免疫的牛血清。

口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因重组杆状病毒的构建与表达

通过设计特异引物,扩增获得口蹄疫病毒3ABC编码区的目的基因片段,将其用SalI和NcoI双酶切后,与经同样处理的带有一段信号肽序列的穿梭质粒pMelBac-B连接,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,获得重组质粒pMel-3ABC.将重组质粒与线性化的杆状病毒骨架Bac-N-Blue共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.用重组病毒感染Sf9昆虫细胞,通过间接ELISA方法,检测细胞培养基上清液中表达的口蹄疫病毒抗原.结果表明,口蹄疫病毒基因片段3ABC正确克隆到杆状病毒载体上,重组病毒可在昆虫细胞中表达目的蛋白.

猪捷申病毒中国株3ABC基因的克隆及序列分析

根据已报道的Swine/CH/IMH/03基因序列设计1对引物,从已分离的中国株捷申病毒中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到3ABC基因.并将该基因克隆到pMD18-T载体中,经序列测序,并与GenBank上的14种毒株序列进行比对.结果表明:猪捷申病株中国株(PTV-3ABC)与F65毒株、PTV-1毒株、Swine/CH/IMH/03毒株和Talfan毒株的同源性比较高,分别为96.5%,99.5%和99.4%分别为99.4%,氨基酸同源性分别为95.6%,98.8%,98.4%和98.8%.系统发育树表明,此中国株捷申病毒属于PTV-1型.

口蹄疫病毒3ABC基因的克隆与测序

参考 Gen Bank中发表的猪源 O型口蹄疫病毒 3 ABC的基因序列 ,设计一对特异引物 ,以猪源 FMDV/ O/ CC株基因组 RNA为模板 ,RT-PCR扩增 3 ABC基因 ,并克隆到 p MD1 8-T载体中。测序结果显示 ,FMDV/ O/ CC株 3 ABC基因 c DNA长 1 2 81 bp,编码为 42 7个氨基酸残基组成的多肽。核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性比较发现 ,FMDV/ O/ CC株和 FMDV/O/ TW/ 99株 3 ABC基因亲缘关系密切。核苷酸同源性为 97% ,推导氨基酸序列同源性为96.3 %。

口蹄疫病毒VP1与3ABC基因片段的克隆及表达

根据GenBank中注册的O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1和3ABC基因序列,设计了2对引物.采用RT-PCR方法从FMDV分离株O/HK/2001扩增得到VP1和3ABC基因.经对它们的核苷酸序列测序和同源性比较,显示与14株O型FMDV参考毒株中的O/HKN/2002同源性最高(分别为98.3%和98.6%),并且在VP1决定各种亚型FM-DV免疫原性的主要抗原决定族的144、148、154和208位关键氨基酸,比对均未发现变异.通过酶切将VP1和3ABC基因分别亚克隆到4个表达载体pET-30a、pPROEX HTb、pQE30和pQE9中构成重组表达质粒,利用IPTG诱导表达,经SDS电泳分析表明这些重组质粒在相应表达宿主菌BL21、DH5α和M15中,除pQE30-3ABC和pQE9-3ABC外均获得了表达,其中pET-30a和pPROEX HTb载体表达量较高.

口蹄疫病毒3ABC基因的扩增与序列分析

参考GenBank中发表的猪源O型口蹄疫病毒 (FMDV) 3ABC的基因序列 ,设计一对特异引物 ,分别以 5株猪源O型FMDV流行毒株基因组RNA为模板 ,通过RT_PCR的方法获得 3ABC基因 ,并克隆到pMD18_T载体中。测序结果显示 :5株O型FMDV流行毒株的 3ABC基因cDNA均为 12 81bp ,编码由 4 2 7个氨基酸残基组成的多肽。同源性比较和系统发育树分析表明 :5株O型FMDV流行毒株亲缘关系密切 。

志贺菌cadABC基因簇缺失情况的检测与分析

目的通过对志贺菌中cadABC基因簇缺失情况的检测,探讨编码赖氨酸利用的基因簇在志贺菌中缺失的普遍性。方法根据大肠杆菌K-12 MG1655菌株的cadABC基因簇序列设计引物,采用PCR和核酸杂交试验检测。结果在所检测的60株志贺菌中,41株B群菌株,5株发生了cadABC基因簇的全部缺失,36株表现为部分缺失;D群的19个菌株全部表现出部分缺失。结论60株志贺菌的2个群5个血清型中,全部发生了cadABC基因簇的缺失,表现为完全缺失和部分缺失。志贺菌的进化可能与cadABC基因簇的缺失有关。

口蹄疫病毒3ABC、3AB、3BC基因克隆、表达及其抗体消长规律的研究

成功克隆了FMDV太保毒株3ABC全基因片段,并将ABC、3AB、3BC片段插入pGEX-4T-1表达载体构建了重组表达质粒,经Western blotting 分析表明,表达的3ABC、3AB蛋白与FMDV阳性血清有反应性,表达的3BC蛋白反应性差。以纯化的3ABC、3AB表达蛋白为抗原建立间接ELISA方法,对背景清楚的试验牛血清进行检测。结果3ABC、3AB表达蛋白与空白对照组(C组)、灭活疫苗反复免疫组(CI组)和部分免疫后攻毒组(I组)牛血清均不发生反应,与未免疫直接攻毒组(D组)和部分I组血清均发生反应;未免疫直接攻毒组3ABC、3AB表达蛋白抗体持续时间几乎相同,至少在90d以上;免疫后攻毒组3ABC比3AB表达蛋白抗体持续时间长,说明3ABC表达蛋白更适合用于FMDV感染动物的检疫。

青海湖盐单胞菌Ectoine合成基因簇ectABC的重组共表达

盐单胞菌属(Halomonas)通过胞内积聚有机相容溶质(Compatible solutes)来抵抗胞外的高盐渗透压。为了探究相容溶质Ectoine合成代谢相关基因的结构特征和异源共表达的可能性,以青海湖盐单胞菌Halomonas sp.QHL1为材料,通过高效液相色谱(HPLC)分析不同盐梯度下QHL1胞内Ectoine的积聚量,并借助于染色体步移技术(Genome walking)捕获QHL1菌株的Ectoine生物合成基因簇ect ABC,利用分子克隆技术分析ect ABC基因簇的异源重组表达(E.coli BL21)。研究结果表明:胞内Ectoine的积聚量随着培养基中Na+浓度的增加而增加,最大积聚量为167.1 mg/g细胞干重(1.0 mol/L Na+),但菌体生长却受到高浓度Na+的强烈抑制作用。QHL1的ect ABC操纵子全长序列为3580 bp,结构基因ect A(579 bp)、ect B(1269 bp)与ect C(390 bp)串联排列。基于生物信息学预测分析,两个启动子(δ70与δ38因子控制)和若干未知功能的保守模序(Motifs)存在于QHL1的ect操纵子上游。构建重组表达载体p ET-28-ect ABC,并在E.coli BL21中异源表达ect ABC基因簇(2438 bp)。SDS-PAGE结果显示Ect A、Ect B和Ect C分别为27.2、52.5和20.8 k D,与预测结果一致,表明ect A、ect B和ect C基因能在E.coli BL21中实现异源共表达,为构建Ectoine合成代谢基因整合的系统代谢工程,并实现低盐发酵控制和过量化生产提供了重要的理论基础。

转基因枳橙中GA20ox1与rol ABC基因互作关系的研究

以转rol基因枳橙实生苗为试验材料,研究其对赤霉素的敏感反应,用荧光定量RT-PCR分析GA20ox1基因和rol基因的表达,并检测幼芽中POD酶活性和植物内源激素含量的变化。结果表明转rol ABC基因枳橙既不属于GA缺陷型,也不属于GA不敏感型,幼芽中GAS、GAS(P【0.05)和IAA显著降低(P【0.01),POD酶活性显著提高(P【0.01)。转rol基因枳橙幼芽中GA20ox1基因mRNA水平相比对照显著下调(P【0.01)。在幼芽、嫩茎中,rol C基因与GA20ox1表达负相关。rol基因通过在幼芽中的高表达下调了GA20ox1基因转录表达,进而抑制了活性GAs在幼芽中的合成,顶端分生组织较低量的活性GAs限制植物茎伸长,在转rol ABC基因枳橙矮化性状建成中发挥重要作用。

RNA干扰ABCE1基因后可增加肺癌95-D/NCI-H446细胞的E-钙黏附蛋白表达并减低细胞侵袭力(英文)

研究ABCE1对肺癌(95-D和NCI-H446)细胞的作用.使用RNA干扰技术,抑制ABCE1基因的表达,通过Western blot分析及FACS检测,观察ABCE1基因对E-钙黏附蛋白在95-D/NCI-H446细胞表达的影响;运用transwell侵袭实验,观察M95-D/NCI-H446细胞侵袭力的变化.RNA干扰ABCE1基因后,实验组与对照组相比,在48h后可显著抑制肺癌(95-D和NCI-H446)细胞ABCE1蛋白的表达,同时,伴随E-钙黏附蛋白的高表达,以及细胞侵袭力的降低.ABCE1基因与E-钙黏附蛋白相关,抑制ABCE1基因可增加肺癌95-D/NCI-H446细胞的E-钙黏附蛋白的表达,减低细胞的侵袭力。

一个玉米类ABC1基因ZmABC1-10的克隆及其对镉等非生物胁迫的应答(英文)

镉是一种非必需的重金属元素,对动植物有严重毒害作用。几个与ABC1(activity of the bc1 complex)家族有关的基因参与植物镉胁迫的应答。本研究从玉米中克隆并鉴定了一个类ABC1基因,命名为ZmABC1-10。该基因cDNA全长2 519 bp,包含一个2 250 bp的开放阅读框,编码一个预测的叶绿体膜蛋白。启动子顺式元件扫描发现该基因含有大量的非生物胁迫、光以及植物激素应答元件。表达模式分析表明,该基因主要在叶片、茎秆等绿色组织中表达。镉处理实验表明,该基因能够被诱导并且受植物发育时期的调控。除镉之外,该基因还受多种非生物因素包括ABA、H2O2、干旱和黑暗的共同调控。此外,本研究利用基因组序列信息共鉴定出19个玉米ABC1基因。对植物界8个代表性物种中148个ABC1蛋白进行系统发育分析表明,在长期进化过程中植物ABC1蛋白已经发生了分化;物种特异性扩张是植物中该家族进化的主要动力。这些结果表明ZmAbc1-10是一个镉应答因子并且可能在植物对非生物胁迫的适应中发挥重要作用。

ABCE1基因siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建针对人ABCE1基因siRNA表达质粒,为进一步研究该基因功能奠定基础。方法:合成含靶向ABCE1基因siRNA转录模板的茎环结构,与两端分别有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒连接,大肠杆菌中扩增,测序鉴定。结果:转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,重组质粒电泳初步说明质粒构建成功,测序结果表明RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express的酶切位点BamHⅠ、HindⅢ之间有71bp的插入片段,其序列与所设计、合成的ABCE1的siRNA转录模板序列一致。结论:siRNA转录模板完整正确地插入RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒中。

ABC家族基因在乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM中的表达及雄黄对其作用初探

目的 探讨阿霉素耐药乳腺癌细胞系MCF 7/ADM的ABC家族基因的表达及其与敏感细胞系MCF 7/S的差异 ,观察中药雄黄对ABC膜转运蛋白超家族中各基因 (mdr 1、mrp、bcrp)表达的影响。 方法 应用RT PCR检测ABC家族基因的转录表达 ,MTT法检测耐药性改变。 结果 ABC家族基因在MCF 7/ADM细胞中均过表达 ,而在MCF 7/S细胞中均未见表达 ;雄黄可下调ABC家族基因的mRNA水平 ,降低化疗药物阿霉素 (ADM)对MCF 7/ADM细胞的IC50 。 结论 乳腺癌MCF 7/ADM细胞获得ADM抗药性 ,与ABC家族基因过表达有密切关系 ;雄黄可部分逆转MCF 7/ADM细胞对ADM的抗药性。

ABCE1基因的siRNA转染对肺癌NCI-H446细胞E-cadherin、β-catenin表达的影响

目的探讨ABCE1基因的siRNA转染对肺癌NCI-H446细胞E-cadherin、β-catenin表达的影响。方法将ABCE1基因的SiRNA表达质粒Si-1、Si-N转染入肺癌NCI-H446细胞,分别为Si-1组、Si-N组。另设正常对照组。用蛋白质印迹和半定量RT-PCR法检测转染后不同时点三组细胞的ABCE1蛋白、mRNA。用免疫组化ABC法检测E-cadherin、β-catenin。结果Si-1组转染96 h后ABCE1 mRNA仅为正常对照组的24.35%,ABCE1蛋白仅为正常对照组的40.82%。Si-1组细胞E-cadherin、β-catenin表达明显高于正常对照组和Si-N组。结论ABCE1基因的siRNA转染能上调肺癌NCI-H446细胞黏附因子E-cadherin、β-catenin的表达。

ABCE1基因siRNA表达质粒的构建及在95-D肺腺癌细胞中的表达

目的构建针对人ABCE1基因siRNA表达质粒,为进一步研究该基因功能奠定基础。方法合成含靶向ABCE1基因siRNA转录模板的茎环结构,与两端分别有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的RNAi-ReadypSIREN-DNR-DsRed-Express质粒连接,大肠杆菌中扩增,测序鉴定,转染到95-D肺腺癌细胞中,观察其表达。结果转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,重组质粒电泳初步说明质粒构建成功,测序结果表明RNAi-ReadypSIREN-DNR-DsRed-Express的酶切位点BamHⅠ、HindⅢ之间有71bp的插入片段,其序列与所设计、合成的ABCE1的siRNA转录模板序列一致,该质粒转染到95-D细胞中表达为红色荧光蛋白。结论 siRNA转录模板完整正确地插入RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒中。