ABC-McAb ELISA和BA-FA技术检测HSV抗原及其在眼科临床诊断中的应用

将生物素—亲和素放大系统(BAS)与McAb ELISA 及FA 技术结合,建立ABC-McAb 和BA-FA 技术,并与组织培养相结合初步应用于眼科临床检测HSV 抗原。实验表明ABC-McAb ELISA 的灵敏度比McAb ELISA 高2.5～4倍,特异性较好,与其它感染眼部的病毒无交叉反应,与病毒分离符合率达96%,特异性95%;BA-FA 技术可直接进行临床标本检测,与病毒分离阳性一致率达91%,该技术与组织培养相结合可明显提高培养24小时阳性检出率。

抗营养因子大豆凝集素夹心ELISA检测方法的建立

为建立灵敏、特异的大豆凝集素(soybean agglutinin,SBA)酶联免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测方法。试验以SBA鼠源单克隆抗体为捕获抗体,SBA兔源多克隆抗血清为检测抗体,羊抗兔酶标抗体为二抗,通过对抗体的工作浓度及反应时间优化,建立SBA的双抗体夹心ELISA检测方法,并用建立的方法检测大豆、大豆粕、膨化大豆粕及酶解大豆粕中SBA含量。结果表明:建立SBA双抗夹心ELISA检测方法的检测范围为39.06~1250 ng/mL,检出限为3.00 ng/mL,样品添加回收率为77.96%~116.15%,变异系数为6.11%~18.34%,与大豆中胰蛋白酶抑制因子BBI、KTI,大豆球蛋白glycinin及大豆伴球蛋白-conglycinin等其他抗营养因子均无交叉反应。大豆中SBA含量显著高于大豆粕、膨化大豆粕及酶解大豆粕(P<0.05);大豆粕中SBA含量显著高于膨化大豆粕及酶解大豆粕(P<0.05);膨化大豆粕显著高于酶解大豆粕中SBA含量(P<0.05)。综上,本研究建立了灵敏度高、特异性好的SBA双抗夹心ELISA检测方法,该方法可用于饲料中大豆凝集素的监控检测。

禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为了建立一种禽白血病病毒(ALV)抗体检测方法,利用原核表达禽白血病病毒的p27蛋白建立一种检测ALV抗体的间接ELISA方法。结果显示,p27蛋白以包涵体形式表达,Western blot检测显示p27蛋白具有良好的反应活性,以p27蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法检测NDV、IBDV、IBV、AIV-H9、ILTV阳性血清均为阴性,最低抗体检出效价为1︰12800,与进口试剂盒的符合率为94.87%,检测临床血清样品的阳性率为14.02%。结果说明该研究建立的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、符合性好,可为ALV的检测和净化等提供一种简单快速的方法。

非洲猪瘟病毒pK205R蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

旨在建立可以检测非洲猪瘟病毒(ASFV)非结构蛋白pK205R抗体的血清学检测方法。基于杆状病毒表达系统构建重组杆粒BacmidpK205R,以纯化的pK205R蛋白为包被抗原,优化各项反应条件,建立间接ELISA抗体检测方法,验证方法的特异性、灵敏性、重复性,并对临床血清样品进行检测。结果显示:pK205R蛋白可以与ASFV阳性血清发生发应,ELISA方法的抗原包被浓度为50 ng/孔,4℃过夜包被,封闭液为2%牛血清白蛋白(BSA),37℃封闭1 h,待检血清以5%脱脂乳进行1∶200稀释,37℃孵育0.5 h;二抗工作浓度为1∶5000,37℃孵育0.5 h,37℃下显色10 min;该方法的阳性临界值为0.186(≥0.186为阳性,<0.186为阴性),且具有良好的特异性、灵敏性、可重复性,与商品化试剂盒符合率为79.92%。本研究成功建立pK205R非洲猪瘟间接ELISA抗体检测方法,为进一步优化和研制非洲猪瘟抗体的快速检测试剂盒提供了参考。

猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

为建立一种猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)血清抗体的快速检测方法,本研究首先经PCR扩增SADS-CoV N基因,纯化鉴定后克隆至表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-N。重组N蛋白诱导表达并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,以兔抗猪HRP-IgG作为二抗,利用方阵滴定法优化各反应条件,建立了一种以SADS-CoV N蛋白为靶标的检测SADS-CoV血清抗体的间接ELISA方法,并对此方法的敏感性、特异性、重复性及临床应用价值进行鉴定。SDS-PAGE及Western blot结果显示,重组表达的N蛋白约为70 ku,且具有良好的反应原性。采用该方法检测SADS-CoV阳性血清抗体效价可达1∶3 200,并且与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪圆环病毒(PCV)阳性血清均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,具有较好的重复性。利用该方法和间接免疫荧光方法(IFA)分别对50份猪临床血清样品进行检测,结果显示二者的总符合率为98%。综上,本研究建立了一种基于SADS-CoV N蛋白的间接ELISA抗体检测方法,可用于临床SADS-CoV血清抗体检测以及流行病学的监测,对防控SADS-CoV的流行具有重要意义。

基于真核表达塞内卡病毒A VP2蛋白的间接ELISA检测方法

为建立检测塞内卡病毒A(SVA)抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),本试验利用昆虫杆状病毒表达系统表达SVA的主要结构蛋白和保护性抗原VP2,通过间接免疫荧光试验(IFA)验证VP2的免疫反应性,并使用氨基三乙酸镍(NiNTA)树脂亲和纯化重组VP2蛋白。以纯化的VP2蛋白为包被抗原,利用棋盘滴定法确定最优的抗原包被浓度和待检血清稀释度,通过优化反应条件和确定临界值,建立了检测SVA抗体的间接ELISA检测方法,并评估了其特异性、敏感性、重复性及与IFA的检测符合率。结果显示,重组VP2蛋白在杆状病毒感染的Sf9细胞内呈现可溶性表达,能够被SVA VP2特异性单克隆抗体2F5识别;经Ni-NTA纯化后,获得了分子量约31 kDa的重组VP2蛋白;间接ELISA的最佳抗原包被浓度为2μg/mL,最佳血清稀释度为1∶100,最佳酶标二抗稀释度为1∶10000;阴阳性临界值为0.287;与口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型抗血清无交叉反应;批内与批间变异系数均低于10%。利用建立的间接ELISA检测了实验室保存的52份猪血清样本,与IFA的检测符合率为96.15%(50/52)。综上,本试验间接ELISA的成功建立为SVA抗体检测和流行病学调查提供了有力工具。

鸭坦布苏病毒E蛋白多克隆抗体的制备及抗体ELISA检测方法的建立

旨在制备鸭坦布苏病毒(DTMUV)E蛋白多克隆抗体并建立抗体检测方法。克隆DTMUV E基因,构建重组质粒pET-32a-E并进行原核表达,对表达蛋白提纯后免疫家兔,制备兔抗DTMUV E蛋白多克隆抗体。以原核表达的E蛋白作为包被抗原,建立了检测抗体的间接ELISA方法。结果:DTMUV E蛋白在大肠杆菌中成功表达,且具有良好的免疫原性,制备的兔源抗DTMUV E蛋白多克隆抗体能够与DTMUV发生良好特异性反应,建立的抗体间接ELISA检测方法具有高敏感性、特异性和重复性。提示:制备的DTMUV多克隆抗体和建立的抗体间接EIISA检测方法为DTMUV的深入研究提供了技术支撑。

禽白血病病毒p27抗原ELISA检测试剂盒的比较与评估

为了更好地进行禽白血病监测与净化,研究使用由蛋清、细胞培养物、胎粪等多种样品组成的样品盘对7种禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)p27抗原ELISA检测试剂盒(国产试剂盒DA、DB、DC,进口试剂盒IA、IB、IC、IDEXX)进行比较。结果显示:从分析特性上看,试剂盒分析特异性均较好,未观察到与其他常见禽源病毒的交叉反应;与IDEXX相比,DA、IA的分析敏感性较高,DB、IC其次,DC、IB较低,对于ALV不同亚群,各种试剂盒分析敏感性差异可达2~3个稀释度;从诊断特性上看,与IDEXX相比,DB、DC和IC的诊断敏感性和诊断特异性均高于90%;DA、IA和IB与IDEXX的诊断敏感性和诊断特异性均高于80%;各试剂盒对于不同类型样品(DF-1细胞培养物、蛋清、胎粪)的诊断敏感性和诊断特异性存在差异;从重复性上看,DA和IA的批内变异系数均在15%以内。综上所述,与IDEXX相比,当前国产p27抗原ELISA检测试剂盒DA和DB、进口p27抗原ELISA检测试剂盒IA和IC的各项性能可满足禽白血病净化各阶段对不同类型样品的检测需求。

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD 450≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。

牛病毒性腹泻病毒E^(rns)-ELISA抗体检测试剂盒的制备

为建立快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的血清学方法,本试验以BVDV NADL毒株结构蛋白E^(rns)作为包被抗原,优化反应条件并组装BVDV酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测试剂盒,通过重复性试验、灵敏性试验、符合率试验和保存期试验验证该试剂盒的准确性、灵敏性和稳定性。结果显示,抗原包被浓度为4μg/mL,1%酪蛋白溶液37℃封闭45 min,被检血清以1∶400稀释孵育30 min,兔抗牛HRP标记二抗以1∶20000稀释孵育30 min,TMB底物反应5 min时,ELISA的反应背景下降,区分度最好。优化后方法的批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均在10%以内,表明该试剂盒具有较好的稳定性;灵敏性试验结果显示,当阳性血清稀释度达到1∶6400时仍可以检测为阳性,说明该试剂盒灵敏度较高;该试剂盒与美国爱德士生物科技公司(IDEXX)BVDV总抗体检测试剂盒共同检测466份临床血清样品,两者总符合率为89.1%;保存期试验结果显示,第4个月时该试剂盒仍能检测到阳性血清,说明稳定性较好。综上表明,本试验利用E^(rns)蛋白建立的BVDV间接ELISA抗体检测试剂盒灵敏度高且重复性好,可为BVDV抗体检测和流行性调查提供新的方法。

抗PCV4 Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立可应用于猪圆环病毒4型(PCV4)候选疫苗特异性抗体检测与评价方法,本研究应用PCV4 Cap蛋白作为抗原,以PCV4多克隆兔源抗体作为一抗,优化各反应的最佳条件并建立了针对PCV4 Cap蛋白抗体的间接ELISA方法。最佳条件为2μg/m L PCV4 Cap纯化蛋白,4℃包被过夜,5%脱脂乳封闭60 min,待检血清稀释比例为1∶800,反应条件为37℃、45 min,酶标抗体稀释比例为1∶5000,反应条件为37℃、60 min,底物显色时间为10 min,Cut of f值为0.157,灵敏度可达102400倍。成功建立的抗PCV4Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法具有良好的敏感性、重复性和特异性。可为检测PCV4候选疫苗的特异性抗体水平提供一种精准、高效的方法。

可变色ELISA样品稀释液制备及其性能检测

为解决酶联免疫吸附法(ELISA)检测过程中样品错加、漏检问题,研制开发了一种可变色ELISA试剂盒样品稀释指示剂,明确了其制备方法,并开展了性能检测评价及其在检测过程的应用特性。可变色稀释指示剂制备方法为:在0.01 mol/L PBS(pH=7.2)基础缓冲液中,加入血清蛋白组分、0.01%可变色指示剂和特效稳定剂,充分溶解后再添加Krovin750防腐剂,定容后即可。结果:制备的可变色ELISA样品稀释显色反应明显,可用于ELISA试剂盒检测中的血清或血浆样本稀释,有效避免检测过程样品跳孔和错加现象;同时对样品具有良好保护,显著提高了检测结果的准确性和稳定性,实现了对样品的有效保护,降低了样品基质背景干扰,提高了检测结果的准确性和稳定性。

基于Penton蛋白禽腺病毒血清4型间接ELISA抗体检测方法的建立

Penton蛋白是构成禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)衣壳的主要结构蛋白,具备高度保守性与良好的免疫原性。以纯化的Penton蛋白为包被抗原,建立一种基于禽腺病毒血清4型Penton蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,Penton蛋白最佳包被质量浓度为2μg/mL,血清稀释倍数为200倍,酶标抗体稀释倍数为1∶5000,阳性临界值为0.222,敏感性可达到1∶6400,与鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒均无交叉反应,特异性良好,批间批内重复性变异系数均<10%,在100份临床血清中阳性检出率为77%,与商品化试剂盒检出符合率可达98%。综上,建立的ELISA抗体检测方法可以用于禽腺病毒4型临床抗体检测。

A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立

[目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以VP2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。[结果]重组VP2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组VP2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定VP2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂乳+5%BSA,血清样品和二抗孵育时间均为90 min, TMB底物反应时间为10 min,临界值为0.182。建立的间接ELISA方法与常见的猪病毒阳性血清不反应,与IFA符合率达94.0%。[结论]原核表达系统表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体能与SVA和VP2发生特异性反应。建立的间接ELISA方法特异性高,与IFA符合率高,适用于临床SVA抗体检测和疫苗效力评价。

猪胞内劳森菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

猪增生性肠病(PPE),通常被称为猪回肠炎(PI),由胞内劳森氏菌(LI)感染引起。为建立检测LI抗体的间接ELISA方法,本研究构建LI外膜蛋白基因(LI0841)的重组表达质粒p ET28a-LI0841,经测序无误后转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE检测重组蛋白LI0841蛋白(rLI0841)的表达形式,经Ni柱纯化后采用western blot鉴定其反应原性。SDS-PAGE结果显示,在32 ku处出现目的条带,且其主要以可溶性形式表达;western blot结果显示,r LI0841能够与兔LI多克隆抗体特异性反应,表明纯化的r LI0841具有较强的反应原性,可作为包被抗原用于建立间接ELISA检测方法,经各反应条件优化初步建立LI抗体的间接ELISA检测方法。各反应条件的优化结果显示,4.38 ng/孔的r LI0841以4℃过夜包被最佳;血清最佳稀释度为1∶100,37℃反应0.5 h;羊抗猪Ig G-HRP最佳稀释度为1∶10000,37℃作用0.5 h;TMB底物37℃显色15 min。利用建立的间接ELISA方法检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、副猪嗜血杆菌、猪链球菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌及经美国Biostone PPE抗体检测试剂盒检测为阳性的猪血清,评估该方法的特异性;将LI阳性血清2倍倍比稀释(1∶100~1∶51200)后,采用本研究建立的间接ELISA方法检测,评估该方法的敏感性;以同一批次和不同批次包被的酶标板分别检测5份不同LI抗体水平的猪血清,评估该方法的重复性。结果显示,该方法除能检测到LI阳性血清外,其余相关病原的阳性血清均为阴性,特异性较强;LI阳性血清1∶800稀释时检测结果仍为阳性,敏感性较高;对5份不同抗体水平的LI阳性血清的批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%,重复性较好。利用该ELISA方法与美国Biostone公司PPE抗体检测试剂盒同时检测104份临床猪血清样品,比较二者的检测结果,并计算二者的符合率;采用建立的间接ELISA方法检测黑龙江、吉林等地区413份临床猪血清样品,分析LI在上述地区的流行状况。结果显示,两种方法的阳性符合率为90.91%,阴性符合率为91.84%,总符合率为91.35%;413份临床猪血清样品中LI的阳性检出率为59.81%(247/413),表明LI在黑龙江、吉林等地区的猪群中普遍存在。本研究建立了检测LI抗体的间接ELISA方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性与准确性均较好,为临床PI血清流行病学调查提供技术支持。

猪肺炎支原体P46-P65重组蛋白的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立猪肺炎支原体(Mhp)血清学调查及免疫评估方法,本研究利用DNAStar生物学软件对Mhp的P46和P65进行抗原表位分析,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得P46-P65融合基因,构建重组表达质粒pETP46-P65,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导后获得了可溶性表达的重组P46(aa33~aa419)-P65(aa307~aa627)蛋白(rP46-P65)。以纯化的r P46-P65为包被抗原,经优化各反应条件后建立了检测Mhp抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示所建立的方法与CSFV、FMDV、PEDV、PCV2、PRV、PRRSV和APP等阳性血清均无交叉反应。该方法可检测到最高稀释至6 400倍的Mhp阳性血清,批内和批间变异系数均小于5%。利用IDEXX试剂盒和本研究建立的方法同时检测298份临床血清样品,前者的检测阳性率为62.4%(186/298),后者的检测阳性率为73.8%(220/298),两者检测结果的总符合率为88.6%。IDEXX检测为阳性的血清,采用本研究建立的ELISA方法检测也均为阳性;而部分Mhp阳性猪经IDEXX试剂盒检测为阴性的血清,该ELISA方法检测结果却为阳性,其中79.4%(27/34)检测结果有差异的血清经Mhp颜色变化试验证明均为阳性,表明本研究建立的ELISA方法的敏感性明显高于IDEXX方法。本研究建立的检测猪Mhp抗体的间接ELISA方法与目前广泛使用的方法相比优势明显,为临床血清流行病学调查及血清抗体水平评估提供了可行方法。

不同ELISA检测方法在检测出壳雏鸡禽白血病病毒感染中的应用

通过雏鸡胎粪中群特异性衣壳蛋白27(p27)抗原检测以判定禽白血病病毒(ALV)垂直传播是实施禽白血病净化的关键步骤,为对比不同ALV-p27抗原ELISA试剂盒对我国四类广泛流行的亚群ALV垂直传播的检测效果,本试验设置ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K感染组,以无菌生理盐水作为对照组,在8胚龄时以卵黄囊接种的方式感染SPF鸡胚,建立鸡胚携带ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K的垂直感染模型。采集各组雏鸡胎粪样品和血浆样品,死亡鸡胚肝脏样品,死亡雏鸡胎粪样品、血浆样品和肝脏样品,其中血浆和肝脏样品需接种鸡胚成纤维细胞系(DF-1细胞)进行病毒分离,各样品以4家公司提供的ALV-p27抗原ELISA试剂盒进行检测,并以实时荧光定量PCR(RT-qPCR)进行平行检测,比较阳性检出率和灵敏度。结果显示,4家公司的ALV-p27抗原ELISA试剂盒对于同一样品的阴阳性判定结果基本一致,但灵敏度存在差异;胎粪样品直接ELISA检测不能将ALV阳性鸡只全部检出,相对于胎粪样品,血浆和肝脏病毒分离样品ELISA检测更具有灵敏度优势。本试验所建立的对比方法不仅有助于评估4家公司ELISA试剂盒的灵敏度,还进一步评估了胎粪样品直接ELISA检测与血浆和肝脏病毒分离样品ELISA检测2种评估方法的灵敏度,为科学选择灵敏特异的ALV检测方法提供了良好评价模型。

基于N和G蛋白的HeV抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立亨德拉病毒(HeV)抗体的间接ELISA检测方法,人工合成HeV的N和G基因,并将其分别连接到原核表达载体PET-30a,经IPTG诱导、变复性处理及纯化后获得表达蛋白,免疫健康马获得阳性血清,用矩阵法对蛋白包被浓度和一抗稀释倍数进行确定,优化包被时间、封闭剂以及孵育时间等技术参数,并对建立方法的灵敏性、特异性、重复性和准确性进行评估。经SDS-PAGE和Western blot验证,N和G两个蛋白均实现高效表达,间接ELISA方法中二者的最佳包被浓度分别为10μg/mL和8μg/mL,一抗血清的稀释倍数为1∶800,优化后的最佳反应条件为:N蛋白4℃包被过夜,5%脱脂奶粉37℃封闭2 h,一抗孵育时间30 min,二抗按1∶8000稀释后37℃作用60 min;G蛋白4℃包被过夜,2%BSA 37℃封闭2 h,一抗孵育时间80 min,二抗按1∶8000稀释后37℃作用80 min。结果表明,所建方法N蛋白的灵敏性大于1∶12800,G蛋白大于1∶6400,二者的临界值分别为0.235和0.267,特异性良好,批内、批间变异系数均小于10%,重复性良好,二者ROC曲线下面积分别为0.91和0.93,准确性高。试验结果可为海关、口岸以及出入境检验检疫等部门HeV临床血清学诊断提供技术支撑。

竞争ELISA和间接ELISA方法应用于牛布鲁氏菌病净化的研究

旨在评价竞争ELISA方法和间接ELISA方法联合使用在布鲁氏菌病(以下简称“布病”)净化中的效果,为布病防控提供技术支撑。采用本实验室开发的动物布鲁氏菌病竞争ELSIA(cELISA)抗体检测试剂盒、牛布鲁氏菌病间接ELISA(iELISA)抗体检测试剂盒及微量法补体结合试验(mCFT),对西北某牛场3 271份牛血清进行检测。本研究采用cELISA初筛、iELISA确诊的净化策略,对检测阳性牛进行淘汰,可疑牛和阴性牛在完全消毒后隔离饲养,并在前一次检测后每隔1个月重新对群体采样,进行多次连续的“检—淘”策略,在群体的个体阳性率低于2%或全部转阴后使用微量补体结合试验(mCFT)进行验证。并在群体全部转阴后继续检测2个月后确定净化结果。结果显示,首次检测阳性率35.36%的感染群体实施本净化策略后,在第1个月阳性率下降至25.41%,第2个月下降至7.16%,第3个月下降为1.86%,到第4个月则实现了布病阳性群体的全面转阴,mCFT验证个体阴性率100%。此后持续检测2个月,个体阳性率均为0,至此实现了感染群体的布病净化,使得群体内近一半的牛免于扑杀,大大减少了经济损失。综上发现,将cELISA用于布病初筛,iELISA用于布病确诊的联合使用,经多次连续检测并结合常规的隔离消毒措施,可以在短时间内实现对于布病感染群体的全面净化。

猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立

旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化后建立了一种检测PCV3抗体的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测50份临床阴性血清,计算阻断率(PI)的临界值,以此来确定该方法的判定标准:当PI≤28.30%时,判定结果为阴性;当PI≥35.05%时,判定结果为阳性;当28.30%<PI<35.05%时,判定为可疑,重复一次试验后如果结果仍为可疑,则判定为阳性。特异性试验表明该方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪瘟病毒(CSFV)的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验表明其检测效价可达到1:128;重复性试验表明批内与批间的变异系数均小于10%;符合性检验表明该方法与PCV检测金标准免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)比对的Kappa值达0.9,具有高度的一致性。综上所述,本研究建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性与较高的符合率,可用于后期进行PCV3抗体的检测,为PCV3的流行病学调查与临床诊断提供技术支持。