RNA干扰ABCE1基因后可抑制肺癌95-D/NCI-H446细胞的增殖和诱导细胞凋亡(英文)

ABCE1作为RNase L抑制剂首先是在脊椎动物中被发现的.前期研究结果显示ABCE1与肺腺癌的发生率及临床分期显著相关.为了进一步研究ABCE1的新功能,构建了ABCE1基因的siRNA表达质粒(RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express vector),培养肺癌细胞(95-D和NCI-H446),用FuGENE6作为转染试剂转染后,使用荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR分析ABCE1基因表达,Westernblot分析ABCE1蛋白的表达,MTT法检测细胞的活性,流式细胞仪分析细胞周期,ELISA法检测细胞凋亡.结果显示:质粒的转染效果较满意,阳性率约为42.70%;在实验组,细胞活性和生长指数明显受到抑制,细胞凋亡明显增加,与对照组比较差异显著(P<0.05).上述结果显示,RNA干扰ABCE1基因可显著抑制肺癌细胞(95-D/NCI-H446)RNA的转录、蛋白质的表达,并增加细胞凋亡,为进一步研究ABCE1基因提供必要的基础.

RNA干扰ABCE1基因后可增加肺癌95-D/NCI-H446细胞的E-钙黏附蛋白表达并减低细胞侵袭力(英文)

研究ABCE1对肺癌(95-D和NCI-H446)细胞的作用.使用RNA干扰技术,抑制ABCE1基因的表达,通过Western blot分析及FACS检测,观察ABCE1基因对E-钙黏附蛋白在95-D/NCI-H446细胞表达的影响;运用transwell侵袭实验,观察M95-D/NCI-H446细胞侵袭力的变化.RNA干扰ABCE1基因后,实验组与对照组相比,在48h后可显著抑制肺癌(95-D和NCI-H446)细胞ABCE1蛋白的表达,同时,伴随E-钙黏附蛋白的高表达,以及细胞侵袭力的降低.ABCE1基因与E-钙黏附蛋白相关,抑制ABCE1基因可增加肺癌95-D/NCI-H446细胞的E-钙黏附蛋白的表达,减低细胞的侵袭力。

ABCE1基因siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的:构建针对人ABCE1基因siRNA表达质粒,为进一步研究该基因功能奠定基础。方法:合成含靶向ABCE1基因siRNA转录模板的茎环结构,与两端分别有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒连接,大肠杆菌中扩增,测序鉴定。结果:转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,重组质粒电泳初步说明质粒构建成功,测序结果表明RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express的酶切位点BamHⅠ、HindⅢ之间有71bp的插入片段,其序列与所设计、合成的ABCE1的siRNA转录模板序列一致。结论:siRNA转录模板完整正确地插入RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒中。

ABCE1基因的siRNA转染对肺癌NCI-H446细胞E-cadherin、β-catenin表达的影响

目的探讨ABCE1基因的siRNA转染对肺癌NCI-H446细胞E-cadherin、β-catenin表达的影响。方法将ABCE1基因的SiRNA表达质粒Si-1、Si-N转染入肺癌NCI-H446细胞,分别为Si-1组、Si-N组。另设正常对照组。用蛋白质印迹和半定量RT-PCR法检测转染后不同时点三组细胞的ABCE1蛋白、mRNA。用免疫组化ABC法检测E-cadherin、β-catenin。结果Si-1组转染96 h后ABCE1 mRNA仅为正常对照组的24.35%,ABCE1蛋白仅为正常对照组的40.82%。Si-1组细胞E-cadherin、β-catenin表达明显高于正常对照组和Si-N组。结论ABCE1基因的siRNA转染能上调肺癌NCI-H446细胞黏附因子E-cadherin、β-catenin的表达。

CCL7和ABCE1在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

目的:通过分析CCL7和ABCE1在非小细胞肺癌中的表达及临床特征,探讨二者的相互关系及临床意义。方法:64例接受肺癌根治手术的非小细胞肺癌患者,收集术后病理标本,通过免疫组织化学染色检测癌、癌旁及转移淋巴结中CCL7及ABCE1的表达,分析其表达情况与肿瘤病理及临床生物学行为之间的关系。结果:CCL7和ABCE1在非小细胞癌和转移淋巴结组织中的表达明显高于癌旁组织,P<0.01。二者在腺癌中的表达高于鳞癌组织,在中、低分化的肺癌组织中的表达高于高分化组,在Ⅲ、Ⅳ期肺癌组织中的表达高于Ⅰ、Ⅱ期,P<0.05。并且CCL7与ABCE1在非小细胞肺癌组织中的表达呈正相关。结论:CCL7和ABCE1在非小细胞肺癌和转移淋巴结中存在高表达,二者结合病理分期有助于疾病严重程度的判断,并为非小细胞肺癌提供了新的研究方向。

miR-145-5p通过靶向ABCE1表达影响人肺腺癌A549细胞的增殖和迁移

目的探讨microRNA (miR)-145-5p在肺腺癌组织中的表达情况及其对人肺腺癌A549细胞增殖和迁移的影响及机制。方法检测人肺腺癌组织和A549细胞中miR-145-5p的基因表达。生物信息数据库预测、双荧光素酶报告基因实验验证miR-145-5p和ABCE1的靶控关系;转染miR-145-5p的模拟物、抑制物和对照物入A549细胞,PCR法测定转染后miR-145-5p和ABCE1 mRNA的表达。MTT和划痕愈合实验检测转染前后A549细胞的增殖和迁移能力。结果在肺腺癌组织和A549细胞系中miR-145-5p表达明显下降(P<0.05)。生物信息数据库和双荧光素酶报告基因实验证实,ABCE1是miR-145-5p的靶基因。与未转染和转染miR-145-5p对照物的A549细胞相比,转染模拟物48 h后可显著增加miR-145-5p的表达,抑制ABCE1 mRNA表达,同时,细胞增殖和迁移能力受到抑制(P<0.05);而转染抑制后可显著降低miR-145-5p的表达,增加ABCE1 mRNA表达,同时,细胞增殖和迁移能力明显增强(P<0.05)。结论在癌组织中表达明显降低的miR-145-5p,能够通过负性调节ABCE1的表达,抑制人肺腺癌A549细胞增殖和迁移,为肺癌治疗提供新的靶点。

ABCE1基因对小细胞肺癌增殖、侵袭、迁移能力的影响

目的构建ABCE1基因的SiRNA表达载体,通过将载体转染入小细胞肺癌细胞株NCI-H446,研究ABCE1基因对小细胞肺癌增殖、侵袭、迁移能力的影响。方法根据ABCE1的DNA序列设计3对SiRNA引物,构建携带红色荧光的重组质粒ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2、ABCE1-SiRNA-N。采用lipofect2000法将载体ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2、ABCE1-SiRNA-N转染入小细胞肺癌细胞中。转染48 h后应用West-ern印迹法检测转染后ABCE1蛋白表达。MTT法、Transwell小室、划痕实验检测NCI-H446细胞在转染前后的增殖能力、侵袭能力、迁移能力的改变。结果经酶切和DNA测序验证,证实ABCE1-SiRNA表达载体构建成功。转染ABCE1-SiRNA后的小细胞肺癌细胞内可见红色荧光。在转染ABCE1-SiRNA-N的NCI-H446细胞中ABCE1基因呈高表达,而转染ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2的细胞呈低表达。MTT实验提示,转染ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2的小细胞肺癌细胞与转染ABCE1-SiRNA-N的同类细胞相比增殖能力受到明显抑制。Transwell实验发现转染ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2后的小细胞肺癌细胞穿膜细胞数较未转染和转染ABCE1-SiRNA-N组细胞明显减少。划痕实验显示转染ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2后的小细胞肺癌细胞迁移速度明显慢于转染ABCE1-SiRNA-N的细胞和对照组细胞。结论成功构建了ABCE1基因SiRNA表达载体ABCE1-SiRNA。ABCE1基因SiRNA表达载体ABCE1-SiRNA-1、ABCE1-SiRNA-2转染人小细胞肺癌细胞后不仅可抑制ABCE1基因的表达,而且还能明显的抑制细胞生长,使其增殖能力下降,降低其侵袭、迁移能力。

沉默ABCE1基因电转染卵巢癌肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性

背景:对肿瘤干细胞相关基因ABCE1的深入研究有可能会发现它在参与恶性肿瘤的发生及进展等方面的重要作用。目的:观察沉默ABCE1基因电转染卵巢癌肿瘤干细胞的增殖特性及对β-榄香烯乳的敏感性。方法:设计合成ABCE1的siR NA序列,通过电转染入卵巢癌肿瘤干细胞。RT-PCR和Western blot检测ABCE1基因沉默后卵巢癌肿瘤干细胞ABCE1 m RNA及蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期变化,MTT法和细胞克隆形成实验分析ABCE1基因沉默后卵巢癌肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性。结果与结论:(1)ABCE1基因沉默后卵巢癌肿瘤干细胞的ABCE1基因和蛋白表达明显降低;(2)ABCE1基因沉默后细胞周期被阻滞在G0/G1期,S期细胞数减少;(3)ABCE1基因沉默后β-榄香烯乳对卵巢癌肿瘤干细胞的增殖抑制率和克隆形成抑制率显著增加;(4)结果表明,沉默ABCE1基因能显著抑制卵巢癌肿瘤干细胞的增殖能力,并能增强肿瘤干细胞对β-榄香烯乳的敏感性。

ABCE1基因siRNA表达质粒的构建及在95-D肺腺癌细胞中的表达

目的构建针对人ABCE1基因siRNA表达质粒,为进一步研究该基因功能奠定基础。方法合成含靶向ABCE1基因siRNA转录模板的茎环结构,与两端分别有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的RNAi-ReadypSIREN-DNR-DsRed-Express质粒连接,大肠杆菌中扩增,测序鉴定,转染到95-D肺腺癌细胞中,观察其表达。结果转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,重组质粒电泳初步说明质粒构建成功,测序结果表明RNAi-ReadypSIREN-DNR-DsRed-Express的酶切位点BamHⅠ、HindⅢ之间有71bp的插入片段,其序列与所设计、合成的ABCE1的siRNA转录模板序列一致,该质粒转染到95-D细胞中表达为红色荧光蛋白。结论 siRNA转录模板完整正确地插入RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒中。

ABCE1-GFP肺腺癌动物模型的建立及免疫组化检测

目的:建立ABCE1-GFP(+)肺腺癌裸鼠动物模型,并进行免疫组化检测,为进一步探索ABCE1作为诊断治疗非小细胞肺癌靶点提供有用的工具。方法:应用前期实验中构建的稳定转染重组质粒p EGFPC1-ABCE1及空载体p EGFP-C1的LTEP-a-2肺腺癌细胞株,接种于裸鼠背部侧翼至腋窝皮下,建立ABCE1-GFP肺腺癌动物模型。进行成瘤情况观察,并予以倒置荧光显微镜系统呈像。取材后进行免疫组织化学检测。结果:稳转细胞系皮下接种裸鼠后,全部成瘤,过表达组肿瘤体积大于空载体及对照组(P<0.05)。过表达组肿瘤在荧光显微镜系统下可稳定表达绿色荧光,成功构建了ABCE1-GFP(+)肺腺癌皮下成瘤的裸鼠动物模型。免疫组织化学检测亦验证这一模型的确立。结论:稳定转染LTEP-a-2肺腺癌细胞可以用来成功建立皮下ABCE1-GFP(+)肺腺癌成瘤模型,是较为理想研究ABCE1在非小细胞肺癌中的基因功能的动物模型。

ABCE1基因siRNA稳定转染小细胞肺癌细胞株阳性克隆的筛选

目的构建携带绿色荧光蛋白的ABCE1基因的siRNA表达载体,通过将载体转染入小细胞肺癌细胞株NCI-H446,筛选稳定转染细胞株。方法根据ABCE1的DNA序列设计3对siRNA引物,构建可用于筛选阳性克隆且带有绿色荧光的ABCE1基因siRNA表达载体ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-1、ABCE1-PRNAT-U6.1/Neo-siRNA-2及ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA-N,采用FUGENE-HD法将载体转染入NCI-H446细胞中,并以G418进行阳性克隆筛选,筛选ABCE1基因沉默的稳定转染细胞系。结果经酶切和DNA测序验证,证实ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA表达载体构建成功。将ABCE1基因siRNA表达载体成功转染小细胞肺癌细胞NCI-H446后,小细胞肺癌细胞内可见绿色荧光,通过G418筛选,获得了ABCE1基因沉默的小细胞肺癌细胞系,该细胞系的ABCE1水平明显低于未转染siRNA的小细胞肺癌细胞。结论成功的构建了ABCE1基因siRNA表达载体ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA。筛选出ABCE1基因沉默的稳定转染小细胞肺癌细胞系,为今后应用ABCE1基因siRNA表达载体研究ABCE1基因的作用机制提供实验基础。

ABCE1基因稳定过表达肺腺癌细胞株的建立

目的构建能够携带绿色荧光蛋白ABCE1基因的表达载体p EGFP-C1-ABCE1,转染肺腺癌细胞株LTEP-a-2,筛选并建立过表达ABCE1基因的细胞株。方法逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增ABCE1全长m RNA,通过酶切、连接ABCE1及表达载体p EGFP-C1,构建重组质粒p EGFP-C1-ABCE1。采用脂质体转染将重组质粒转染至LTEP-a-2细胞,并以G418筛选阳性克隆,建立起能稳定过表达ABCE1基因的细胞株。结果成功构建重组质粒载体p EGFP-C1-ABCE1,并通过酶切及基因测序验证。将重组质粒成功转染入LTEP-a-2细胞,通过G418筛选后(600μg/m L),获得的细胞株能够稳定持续地表达绿色荧光,其ABCE1基因表达明显高于野生型肺腺癌细胞。结论成功构建了ABCE1表达载体p EGFP-C1-ABCE1,建立稳定过表达ABCE1基因的肺腺癌细胞株LTEP-a-2,为进一步研究ABCE1在肺腺癌中的功能及机制打下了基础。

ABCE1基因在非小细胞肺癌内相关调节miRNA的筛选

目的：筛选ATP结合盒E1（ABCE1）基因的相关调节miRNA，为诊治肺癌提供新思路。方法选取20例非小细胞肺癌患者，其中男性13例，女性7例；年龄45～73岁，平均年龄62.9岁。鳞癌11例，腺癌9例。应用生物信息学预测ABCE1基因上游的miRNA，通过实时定量聚合酶链反应（RT-Q-PCR）及免疫组织化学方法，对标本非小细胞癌组织和癌旁组织进行检测，并进行统计学分析，从中筛选出目的miRNA。结果生物信息软件预测7个最有可能调节 ABCE1基因的miRNA，分别为miR-29a/b/c、miR-135a/b、miR-203及miR-141；其中miR-29a/b/c、miR-135a、miR-203的表达在癌组织内较癌旁组织都有不同程度的降低，以miR-135a、miR-29c差异最为明显，与之对应ABCE1在相同的肺癌组织内表达上调（P〈0.05）；仅miR-135a与ABCE1在上述肺癌患者内表达呈现负性相关（r=-0.665，P=0.001）。结论在非小细胞肺癌内，很有可能是miR-135a负性调节ABCE1基因，两者结合可能成为诊治肺癌的新靶点。

ABCE1基因pEGFP重组表达载体构建及转染小细胞肺癌细胞

目的:构建ABCE1基因的pEGFP重组表达载体pEGFP-C1-ABCE1,并将其转染至小细胞肺癌细胞(NCI-H446),观察其表达,并检测转染前后细胞增殖情况。方法:RT-PCR扩增ABCE1基因cDNA,酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-C1重组获得重组表达载体pEGFP-C1-ABCE1。经酶切,电泳,DNA测序鉴定后应用Fugene-HD将重组表达载体pEGFP-C1-ABCE1及空载体pEGFP-C1分别转染NCI-H446细胞,观察pEGFP-C1-ABCE1和pEGFP-C1在小细胞肺癌细胞的表达,MTT法检测转染ABCE1基因对小细胞肺癌细胞增殖的影响。结果:ABCE1基因cDNA片段成功重组到pEGFP-C1载体中。经酶切和DNA测序验证,插入载体的cDNA片段为ABCE1基因。荧光显微镜观察转染pEGFP-C1-ABCE1的NCI-H446细胞绿色荧光蛋白主要在胞浆表达而转染pEGFP-C1的NCI-H446细胞绿色荧光蛋白在胞浆及胞核均有表达。MTT实验提示转染pEGFP-C1-ABCE1的细胞与转染pEGFP-C1和未转染的同类细胞相比增殖能力明显增加。结论:成功构建了pEGFP-C1-ABCE1真核细胞重组表达载体,并将该载体转染入小细胞肺癌细胞,该载体的绿色荧光主要在NCI-H446细胞胞质表达,提示ABCE1基因可能主要在胞质表达。该基因与小细胞肺癌的增殖活性有关。

RNA介导ABCE1基因沉默对肺癌细胞95-D增殖、凋亡的影响

目的研究构建的ABCE1基因SiRNA表达质粒基因沉默效果,及其对95-D肺癌细胞株增殖、凋亡能力的影响。方法运用转染试剂FuGENE 6对3种不同的ABCE1基因SiRNA表达质粒在95-D肺癌细胞中进行转染,并用G418筛选,荧光显微镜观察3种质粒的转染效果,收集转染细胞,计数转染细胞总数、运用MTT法检测细胞活力,用ELISA法检测细胞凋亡。结果①转染的细胞表达红色荧光蛋白,荧光显微镜结果表明,重组质粒转染效率达42.7%。②实验组的细胞增殖低于对照组、而细胞凋亡高于对照组(P<0.05)。结论ABCE1特异性siRNA可明显抑制ABCE1基因转录和表达,并能有效诱导95-D细胞的凋亡,为下一步在体内利用Si-1重组质粒沉寂ABCE1基因,促肿瘤细胞的凋亡提供实验基础。

肺癌转移相关基因ABCE1的筛选

①目的从肺癌转移相关的3个候选基因片段(C1、L1、L2)中筛选出目的基因片段,并克隆其基因全长。②方法 3种肺癌细胞株及4种肺癌手术标本总RNA的提取;运用RT-PCR技术中,对肺癌转移相关基因C1、L1、L2片段进行验证,钓取目的片段;运用RACE(cDNA末端快速扩增)技术克隆出其基因全长序列,并登录Genbank,进行序列比对,确定克隆的基因性质。③结果在NCI-H446细胞和95-D细胞中未得到C1和L1基因目的大小片段,只有L2基因目的片段;从2种细胞株中均得到L2基因的3′端部分未知序列1169 bp;从NCI-H446细胞中得到L2基因的5′端未知序列178 bp,从95-D细胞中145bp。3′、L2基因序列与已知的ABCE1基因序列同源性100%。④结论从已知的3个片段C1、L1、L2中,成功筛选与肺癌转移相关基因L2即ABCE1基因。

ABCE1特异性siRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定ABCE1基因短发夹状干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,以便进一步研究ABCE1的功能。方法针对已经筛选确定的ABCE1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/GFP载体连接、转化,产生pLV-sh-ABCE1慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pLV-sh-ABCE1、pHelper 1.0和pHelper 2.0 3种质粒共转染包装细胞人胚肾293T细胞,包装产生重组慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR和测序证实,成功构建ABCE1shRNA的慢病毒载体pLV-sh-ABCE1。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×108TU/ML。结论成功构建ABCE1基因shRNA慢病毒载体,为应用RNAi研究ABCE1功能奠定基础。

ABCE1与MMP-9在非小细胞肺癌组织中的表达及相关性

目的:探讨非小细胞肺癌组织中ABCE1与MMP-9表达及其二者之间的相关性。方法:采用免疫组化和qRT-PCR技术检测30例非小细胞肺癌组织及对应的癌旁组织中ABCE1、MMP-9的表达水平,分析其在非小细胞肺癌组织中的表达及相关性。结果:癌组织中ABCE1和MMP-9蛋白的表达明显高于癌旁组织。ABCE1和MMP-9 mRNA在癌组织中的表达也明显高于癌旁组织(P<0.001)。高表达ABCE1 mRNA癌组织中MMP-9 mRNA表达也较高,二者之间存在正相关(r=0.596,P=0.001)。结论:在非小细胞肺癌组织中,ABCE1基因可能通过提高MMP-9的表达从而促进了NSCLC的侵袭转移过程。

miR-145通过靶向ABCE1发挥抗乳腺癌作用

目的探讨miR-145靶向调节ABCE1的分子机制及其在抗乳腺癌细胞增殖中的作用。方法利用生物信息学方法筛选出靶向调节ABCE1的miR-145,取乳腺癌组织和癌旁组织检测ABCE1和miR-145的表达水平。通过在乳腺癌细胞MCF-7中转染miR-145 mimic和inhibitor,分析miR-145对ABCE1的蛋白表达及细胞凋亡的影响。采用荧光素酶报告基因实验验证miR-145对ABCE1 mRNA的靶向调节作用。结果在乳腺癌组织中ABCE1蛋白的表达明显高于癌旁组织,同时miR-145在癌组织中的含量显著降低。在MCF-7细胞中转染miR-145 mimic后能抑制ABCE1的表达,同时促进细胞凋亡。此外,在293T细胞中共转染miR-145 mimic和psiCHECK-ABCE1-3'UTR后,发现荧光素酶活性受到明显抑制。结论miR-145可通过靶向沉默ABCE1 mRNA来抑制乳腺癌细胞增殖,提示miR-145对ABCE1的调控可作为治疗乳腺癌的途径之一。

ABCE1基因沉默对人宫颈癌XB1702细胞生物学特性的影响

背景:随着基因工程以及肿瘤生物分子学等新兴学科的发展壮大,基因治疗肿瘤成为一种新的治疗模式。目的:探讨ABCE1基因沉默对人宫颈癌XB1702细胞的生长、增殖及迁移等方面的影响。方法:设计及合成ABCE1的siR NA序列,LipofectamineTM 2000转染XB1702细胞。以转染NC siR NA载体细胞为对照组,未转染的宫颈癌XB1702细胞为空白组。通过RT-PCR、Western blot检测RNA干扰后ABCE1 mR NA和蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期,并通过CCK-8增殖实验、划痕愈合实验、细胞侵袭实验评价沉默ABCE1基因对人宫颈癌XB1702细胞增殖、迁移以及侵袭能力的影响。结果与结论:实验组ABCE1 mR NA和蛋白表达明显低于对照组和空白组(P<0.05)。实验组细胞的生长速度明显减慢,细胞被阻滞在G0/G1期,S期细胞数减少。与对照组和空白组相比,实验组XB1702细胞的增殖受到明显抑制、迁移能力和侵袭能力显著下降(P<0.05)。结果表明特异性干扰ABCE1基因表达可抑制人宫颈癌XB1702细胞的迁移能力,并抑制肿瘤细胞增殖,因此,ABCE1的siR NA序列可能成为治疗宫颈癌的有效靶点。