H_2O_2对Apg-2与BCR/ABL蛋白亚细胞定位的影响

目的观察H2O2对Apg-2与BCR/ABL蛋白亚细胞定位的影响。方法用50μmol/L H2O2分别处理BaF3-BCR/ABL、BaF3-MIGR1及过表达Apg-2蛋白的BaF3-BCR/ABL细胞,激光共聚焦显微镜观察细胞内Apg-2、BCR/ABL蛋白的亚细胞定位变化。结果 Apg-2和BCR/ABL蛋白在细胞中定位于胞浆,H2O2损伤可致Apg-2和BCR/ABL蛋白在BaF3-BCR/ABL细胞中发生核转位,Apg-2蛋白过表达可引起BCR/ABL蛋白核转位。结论 Apg-2蛋白在H2O2诱导的损伤后发生核转位,可能与BCR/ABL蛋白相互作用,保护H2O2诱导的细胞损伤。

ABL酪氨酸激酶及突变体蛋白ABL^(T315I)的分离纯化及活性鉴定

目的建立一种简单、稳定、高效分离纯化ABL酪氨酸激酶及其突变体ABLT315I的方法。方法 abl及其定点突变基因插入p ET-28a载体后,与p GEX6P-1-ptp-1b共同转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中进行培养,加入异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导ABL酪氨酸激酶及其突变体的表达,亲和层析和凝胶过滤层析纯化蛋白,SDS-PAGE分析蛋白纯度与相对分子量,BCA法测定蛋白浓度,ATP/NADH偶联法测定蛋白激酶活性。结果 SDS-PAGE显示ABL及ABLT315I蛋白具有很高的纯度,并且其浓度分别达到28 mg/L(LB菌液)和20 mg/L(LB菌液)。2种目的蛋白在体外均测得了很好的酪氨酸激酶活性。结论本研究成功建立了一种稳定、简单高效的ABL蛋白及其突变体的分离纯化方法,为后续蛋白进行高通量药物筛选和结构分析建立良好的基础。

TAT蛋白转导结构域介导的BCR/ABL融合蛋白在小鼠体内的跨膜转运

目的 探讨HIV 1反式激活蛋白 (TAT)的蛋白转导结构域 (PTD)介导的BCR ABL(TATPTD BCR ABL)融合蛋白在小鼠体内的跨膜转运和通过血脑屏障作用。方法 在大肠杆菌中表达PTD BCR ABL融合蛋白 ,经Ni NTA树脂亲合层析 ,纯化后的融合蛋白经小鼠尾静脉注射体内 ,用免疫组织化学方法对小鼠组织细胞内的PTD BCR ABL融合蛋白进行检测。结果 ①表达和纯化了分子量为 2 3× 10 3的PTD BCR ABL融合蛋白 ;②在接受融合蛋白的小鼠肝、脾、肾及心肌组织的细胞内检测到了PTD BCR ABL融合蛋白 ;③接受融合蛋白的小鼠脑组织细胞中可以检测到融合蛋白的存在。结论 PTD可在体内介导较大分子量的融合蛋白进入组织细胞和通过血脑屏障 。

泛素连接酶β-TrCP降角翠BCR-ABL融合蛋白对白血病K562细胞增殖的抑制

目的:t(9;22)(q34;q11)突变导致的BCR-ABL融合基因及其编码的融合蛋白在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)发病中发挥重要作用。本研究观察可与BCR-ABL融合蛋白N端寡聚化区域(Oligomerization domain,OD)特异性结合的嵌合泛素连接酶E3 β-TrCP的β-TrCP-OD-HA的重组腺病毒载体,经泛素-蛋白酶体途径降解BCR-ABL融合蛋白对白血病K562细胞增殖的影响。方法:HEK293细胞扩增野生型Ad5β-TrCP-OD-HA、突变型Ad5ΔF-TrCP-OD-HA及空载Ad5GFP重组腺病毒载体,感染K562细胞。以未感染K562细胞作空白对照,流式细胞术检测重组腺病毒载体感染效率,Western blot检测外源性重组蛋白和BCR-ABL融合蛋白的表达,通过细胞增殖曲线、甲基纤维素集落形成试验、细胞周期检测β-TrCP-OD-HA对K562细胞增殖的影响。结果:成功建立携β-TrCP-OD-HA重组腺病毒载体的K562细胞株,重组腺病毒载体感染效率达66.4%以上,β-TrCP-OD-HA、ΔF-TrCP-OD-HA可在K562细胞中表达。三组重组腺病毒载体感染K562细胞后,Ad5β-TrCP-OD-HA组Western blot检测BCR-ABL融合蛋白含量下降;K562细胞生长和集落形成能力均受抑制;细胞周期显示S期细胞数下降至10.88%±2.42%、G_0/G_1期升高至85.6%±5.61%,与Ad5β-TrCP-OD-HA组、Ad5GFP组及对照组相比,差异具有统计学意义(P均<0.05)。结论:重组腺病毒介导的β-TrCP-OD-HA、ΔF-TrCP-OD-HA能够在白血病K562细胞中表达;β-TrCp-OD-HA可以抑制K562细胞的生长增殖,其机制可能与其降解BCR-ABL融合蛋白、阻滞细胞周期而实现。

胃癌组织中靶向Abl相互作用蛋白-1的microRNA筛选

目的检测3种Abl相互作用蛋-1(ABI-1)相关的microRNA(miRNA)在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达模式,筛选出与胃癌组织相关的靶向ABI-1的miRNA。方法收集59例胃癌术后蜡块标本,包含胃癌组织和癌旁正常组织,抽提石蜡组织中的总RNA。在基因网选择ABI-1相关的miRNA(即miR-181c、miR-148b、miR-9),采用逆转录实时荧光定量PCR法对胃癌组织及癌旁正常组织中的3种miRNA进行检测,计算胃癌组织相对癌旁正常组织中miRNA的相对表达量(2-ΔΔCt)。结果 miR-181c、miR-148b、miR-9在胃癌组织中的相对表达量分别为(2.32±1.04)(P=0.000)、(0.82±0.67)(P=0.321)、(1.07±0.95)(P=0.774),其中miR-181c在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达差异有显著性(P=0.000)。结论 miR-181c在胃癌组织中相对高表达,提示其可能作为靶向ABI-1的miRNA调节ABI-1蛋白的表达,为进步研究靶向ABI-1miRNA在胃癌发生发展中的作用奠定基础。

Abl相互作用蛋白1过表达对胃癌细胞系AGS体外凋亡及迁移的影响

目的研究Abl相互作用蛋白1(ABI1)过表达对人胃癌细胞系AGS体外凋亡及迁移的影响,初步探讨ABI1在胃癌发生发展中可能的作用机制。方法首先应用脂质体转染方法分别将基因重组表达载体鼠干细胞病毒(MSCV)-绿色荧光蛋白(GFP)-ABI1质粒和对照载体MSCV-GFP质粒导入胃癌细胞系AGS,用嘌呤霉素筛选获得稳定表达MSCV-GFP-ABI1和MSCV-GFP的细胞系;其后应用流式细胞仪及Transwell小室检测ABI1过表达对AGS细胞体外凋亡及迁移能力的影响。结果流式细胞仪检测显示,AGS细胞凋亡率与ABI1过表达后AGS细胞凋亡率无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);Transwell小室检测显示,AGS细胞迁移能力与ABI1过表达后AGS细胞迁移能力比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 ABI1过表达抑制胃癌细胞系AGS的体外迁移能力,提示影响胃癌细胞的迁移可能是ABI1在胃癌发生发展中发挥作用的重要途径之一。

Abl相互作用蛋白-1在肿瘤基础与临床研究中的进展

Abl相互作用蛋白-1(Abl interactor protein 1,Abi1)作为接合蛋白参与肌动蛋白重建,在细胞的多种生物学行为中发挥重要的作用;通过形成不同的大分子复合物,调控着多种与肿瘤细胞增殖、凋亡、黏附、迁移等相关的信号传导通路;并与某些类型的白血病及部分恶性实体肿瘤的发生发展密切相关。Abi1作为潜在的分子靶点在肿瘤的基础和临床研究中显示出广阔的研究前景。

针对bcr/abl融合蛋白的治疗研究进展

bcr/abl融合蛋白在慢性粒细胞白血病的发生与发展中扮演着重要的角色,针对bcr/abl为靶点的治疗已成为当前研究的热点。结合近年来的大量相关文献,对目前的研究现状进行综述并给予相应的评价。

bcr/abl融合蛋白对细胞DNA损伤修复功能的影响

目的:建立稳定表达bcr/ablP210融合蛋白的小鼠转化细胞株BaF3-P210的DNA损伤模型,探讨bcr/abl融合蛋白对细胞DNA损伤修复功能的影响.方法:彗星实验检测不同浓度H2O2诱导的BaF3-P210细胞的DNA损伤建立DNA损伤模型,以空载体转染BaF3-MIGR1细胞为对照;用彗星实验对两组细胞在DNA损伤后的修复进行不同时间段的动态观测.结果:彗星实验确定了细胞DNA损伤模型的建立条件是:采用50μmol/L终浓度的H2O2对BaF3-MIGR1细胞和BaF3-P210细胞进行染毒,H2O2作用温度和时间均为4℃,10min.BaF3-P210细胞与BaF3-MIGR1细胞相比DNA损伤后修复时间缩短,在损伤后60min即可达到完全修复,而后者在损伤后120min才能完全修复(P<0.05).结论:建立了表达bcr/ablP210融合蛋白的小鼠转化细胞株BaF3-P210细胞的DNA损伤模型,并发现bcr/abl融合蛋白可增强BaF3-P210细胞的DNA损伤后修复能力.

BCR/ABL融合蛋白对鞘氨醇激酶和1-磷酸鞘氨醇分泌的影响

目的研究高表达BCR/ABL融合蛋白对人鞘氨醇激酶(SPK)表达、活性及1-磷酸鞘氨醇(S1P)分泌的影响。方法使用pLXSN和pLXSN-bcr/abl的重组逆转录病毒感染HL-60和ECV304细胞并筛选出pLXSN和pLXSN-bcr/abl的细胞。利用RT-PCR鉴定病毒转染。WesternBlot检测SPK表达,γ-32P-ATP掺入法检测细胞SPK活性和培养上清的S1P含量。应用同样方法检测不同剂量Gleevec对K562细胞培养上清中S1P的影响。结果RT-PCR结果显示bcr/abl基因转染成功。高表达BCR/ABL融合蛋白的HL-60和ECV304均比转染空载体后的细胞SPK表达、活性和S1P分泌均显著提高。随着Gleevec浓度的增加,K562细胞培养上清中S1P的含量逐渐减少。结论BCR/ABL融合蛋白可提高细胞SPK表达、活性和S1P分泌。

BCR/ABL-OD结构域重组蛋白的表达和纯化

目的:制备BCR/ABL OD结构域-HIS的重组蛋 白.方法:用RT-PCR方法扩增BCR/ABL OD结构域的基因 片段,测序正确后将其克隆入原核表达载体pET16b中,并进 行酶切鉴定,鉴定正确后转化大肠杆菌BL21,构建表达His- OD融合蛋白的菌株.经IPTG诱导表达后,镍 次氮基三乙酸 (Ni NTA)琼脂糖进行亲和层析纯化,用SDS-PAGE对该融 合蛋白的表达产率及蛋白纯度进行了分析.结果:获得了 His-OD重组融合蛋白,纯度在95%以上,产物得率约75%. 结论:成功制备高纯度His-OD融合蛋白,为进一步研究OD 结构域的生物学功能奠定了基础.

汉防己甲素联合屈洛昔芬对K562细胞bcr/abl表达的影响

为了研究汉防己甲素 (Tet)联合屈洛昔芬 (DRL)对K5 6 2细胞株凋亡相关因子bcr ablmRNA及蛋白表达的影响 ,Tet(1μmol L)和DRL(5 μmol L)单用及联合应用于K5 6 2细胞一定时间后 ,分别采用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)和Westernblot方法检测K5 6 2细胞bcr ablmRNA和蛋白表达的变化。结果表明 :Tet和DRL单独应用对K5 6 2细胞bcr ablmRNA及蛋白表达均无影响 ,两药联合应用于 4 8小时K5 6 2细胞bcr ablmRNA表达开始下调 ,K5 6 2细胞P2 1 0 BCR ABL蛋白表达于 72小时开始下调。结论 :Tet和DRL联合应用可下调K5 6 2细胞bcr abl的表达 ,这可能是两药联用逆转耐药的机制之一。

抗PTD-bcr/abl单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备单克隆抗体(mAb)并初步用于PTD-bcr/abl融合蛋白的研究,为慢性粒细胞白血病的免疫治疗提供实验依据。方法:在大肠杆菌中表达PTD-bcr/abl融合蛋白,用所获得的蛋白免疫BALB/c小鼠,常规收集小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合,筛选杂交瘤细胞株的阳性克隆,并对其进行一系列鉴定。结果:(1)表达PTD-bcr/abl融合蛋白;(2)制备了抗PTD-bcr/abl融合蛋白mAb;(3)用mAb以多种方法检测PTD-bcr/abl融合蛋白,证实此抗体效价高,特异性强。结论:此抗体可用于PTD-bcr/abl融合蛋白的进一步研究。

bcr-abl逆转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病样模型的建立

目的：构建bcr-abl逆转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病（CML）样模型,为深入研究CML发病机制和治疗奠定基础.方法：bcr-abl逆转录病毒Mig210载体经Phoenix-Ampo细胞包装后,取上清液感染5-FU处理后的BALB/c雄性小鼠骨髓细胞,再经尾静脉移植入经致死剂量γ射线（900cGy）照射的同种雌性受体鼠中.用形态学、RT-PCR和Western Blot鉴定小鼠成模情况.结果：小鼠移植8-9 wk后,外周血白细胞达2×10^10-3×10^10/L（为对照鼠的5-8倍）,外周血涂片幼稚细胞达到0.10-0.20;骨髓粒系细胞显著增高,易见幼稚细胞,肝脾也可见白血病细胞浸润;移植4-5 wk后在受体鼠骨髓和脾脏检出bcr-abl融合基因,8-9 wk后在肝脏亦检测出bcr-abl融合基因,同时在骨髓和脾脏也检测到bcr-abl融合蛋白.建模成功的小鼠3-5 mo后相继死亡.结论：成功建立bcr-abl逆转录病毒介导的小鼠CML模型,可用于后续CML信号通路和治疗机制的研究.

抗PTD-bcr/abl多克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备多克隆抗体并初步用于PTD -bcr/abl融合蛋白的研究 ,为慢性粒细胞白血病的免疫治疗提供实验依据。方法 在大肠杆菌中表达PTD -bcr/abl融合蛋白 ,用所获得的蛋白免疫家兔得到多克隆抗体 ,并用免疫组化染色 ,Western -blot等方法进行此抗体的鉴定。结果 ①表达PTD -bcr/abl融合蛋白。②制备了抗PTD -bcr/abl融合蛋白多克隆抗体。③并用多克隆抗体以多种方法 ,检测PTD-bcr/abl融合蛋白 ,证实此抗体效价高、特异性强。结论 此抗体可用于PTD

PTD-ABD融合蛋白对髓系白血病细胞的增殖和凋亡的影响

目的研究癌基因BCR/ABL C末端肌动蛋白结合域(actin-binding domain,ABD)蛋白对白血病细胞增殖和凋亡的影响。方法构建含有ABD基因的重组表达载体,应用蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)将蛋白转入白血病细胞内,应用Western blot与免疫荧光法确定蛋白是否进入白血病细胞,然后分别应用流式细胞仪及MTT法检测融合蛋白对白血病细胞凋亡及增殖的影响。结果成功构建PTD-ABD融合表达载体,获得高纯度PTD-ABD融合蛋白。同时构建PTD表达载体并获得高纯度表达蛋白。将PTD、PTD-ABD蛋白与白血病细胞K562、HL60共培养,Western blot与免疫荧光法确定PTD、PTD-ABD蛋白成功进入细胞内。与阴性对照比较,PTD-ABD蛋白能显著抑制HL60细胞的生长,并且对HL60细胞的凋亡具有明显的促进作用,差异具有统计学意义(P<0.05),但对K562细胞的增殖及凋亡无影响(P>0.05);PTD蛋白对K562、HL60细胞的增殖及凋亡无影响,与阴性对照比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论PTD转导的ABD蛋白抑制HL60细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。

PMA特异性抑制K562细胞BCR/ABL和Fyn mRNA的表达

目的:研究12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波酯(PMA)对K562细胞BCR/ABL与Fyn mRNA表达的影响及两者之间的关系。方法:1～250μg/L PMA刺激K562细胞24 h后,应用实时荧光定量PCR技术检测各组BCR/ABL和Fyn mRNA的水平。结果:PMA明显抑制BCR/ABL和Fyn mRNA的水平,该下调作用均具有显著的量效关系,且BCR/ABL和Fyn的mRNA表达水平下调表现出明显的相关性。比较刺激Molt-4细胞株的结果,PMA抑制作用具有细胞选择性。K562细胞株经诱导后出现伪足样的形态改变。结论:PMA通过抑制BCR/ABL融合基因的转录下调Fyn转录水平。

热休克蛋白90AB1在肝细胞癌中的表达及初步验证

目的:探讨热休克蛋白90ABl(heat shock protein 90 kDa alpha,class B member 1,Hsp90AB1)在肝细胞癌中的表达意义。方法:使用免疫组织化学染色方法检测肝细胞癌组织芯片中Hsp90AB1的表达。运用生物信息学技术分析肝细胞癌相关基因芯片GSE54238;在数据库GEPIA中分析Hsp90AB1基因在正常肝组织及肝癌组织中的表达,对肝癌患者根据Hsp90AB1的表达差异进行生存分析。qRT-PCR检测Hsp90AB1基因在正常肝细胞系及肝癌细胞系中的表达。结果:免疫组化实验发现,与正常肝组织相比,Hsp90AB1在肝癌组织中表达上调(P<0.05)。对基因芯片GSE54238的生物信息学分析显示Hsp90AB1基因在正常肝组织和肝癌组织中的表达存在差异。GEPIA数据库分析发现Hsp90AB1基因在肝癌组织中显著过表达(P<0.05)。生存分析显示,Hsp90AB1高表达的肝癌患者预后相对较差(P<0.01)。相对于正常肝细胞系,Hsp90AB1在肝癌细胞系中高表达(P<0.05)。结论:Hsp90AB1基因可能是肝细胞癌潜在的促癌基因,其高表达可能与肝细胞癌患者较差的预后相关。

bcr/abl反义寡聚脱氧核苷酸抑制慢性粒细胞白血病细胞生长的研究

目的:研究bcr/ abl基因的反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASON)对K5 6 2细胞生长的影响。方法:根据bcr/ abl基因类型(b3/ a2 )的c DNA序列分析,以其m RNA融合区的18个核苷酸为作用靶序列,人工合成了18聚ASON片段,同时合成18聚无义ASON片段,作为序列特异性对照。用ASON和无义ASON片段与K5 6 2细胞共同培养,同时设置空白对照组,作用一定时间后分别测定细胞动力学、3H- Td R掺入率、bcr/ abl m RNA和P2 10蛋白的表达。结果:3.5～30 .0 μmol·L- 1的ASON对K5 6 2细胞生长有不同程度的抑制作用,ASON浓度低于10 .0 μmol·L- 1时抑制作用很小,大于10 .0 μm ol·L- 1时抑制作用显著,这种作用有浓度、时间依赖关系,而无义ASON与空白对照组比较差异无显著性(P<0 .0 5 )。同时发现ASON使细胞的3H - Td R掺入率下降,bcr/ abl m RNA及P2 10蛋白的表达下降。结论:ASON的抑制作用是从基因水平上封闭了bcr/ abl m RNA转录及P2 10蛋白的翻译,抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡。ASON对慢性粒细胞白血病(CML )细胞有抑制作用。

小檗胺诱导K562细胞凋亡及其与bcr/abl gene及P210表达的关系

目的 :探讨小檗胺 (BER)诱导K5 6 2细胞凋亡及其可能的机制。方法 :以流式细胞仪 (FCM)分析、电镜观察细胞微结构变化及基因组DNA电泳等方法检测细胞凋亡。以RT -PCR及Westernblot方法检测K5 6 2细胞BCR/ABLmRNA和蛋白质水平表达。结果 :FCM检测见到典型的凋亡峰 ,8 0mg/LBER作用 2 4 - 72h ,随药物作用时间延长 ,细胞凋亡率由 (2 9 2 0± 3 82 ) %上升至 (6 1 77± 4 35 ) % (P <0 0 1) ;以 2 0 - 8 0mg/LBER作用 2 4h ,随药物浓度增加 ,K5 6 2细胞的凋亡率也增加。电镜下可见明确的细胞凋亡的形态学改变。DNA电泳呈现典型的梯形条带。 16 0mg/LBER处理 2 4h ,K5 6 2细胞bcr/ablmRNA相对表达量及BCR/ABL融合蛋白质P2 10水平均明显低于对照组 ,分别为 0 73± 0 0 2vs 1 19± 0 0 2 (P <0 0 1)和 0 6 3± 0 0 1vs 1 0 4± 0 0 2 (P <0 0 1) ,呈时间 -浓度依赖效应。经BER作用后 ,K5 6 2细胞bcr/ablmRNA表达强度与P2 10水平呈正相关 (r =0 92 8,P <0 0 5 ) ,且细胞凋亡率与bcr/ablmRNA表达呈负相关 (r=- 0 997,P <0 0 1)。结论 :在体外BER对K5 6 2细胞有明显的促凋亡作用 。