TAT蛋白转导结构域介导的BCR/ABL融合蛋白在小鼠体内的跨膜转运

目的 探讨HIV 1反式激活蛋白 (TAT)的蛋白转导结构域 (PTD)介导的BCR ABL(TATPTD BCR ABL)融合蛋白在小鼠体内的跨膜转运和通过血脑屏障作用。方法 在大肠杆菌中表达PTD BCR ABL融合蛋白 ,经Ni NTA树脂亲合层析 ,纯化后的融合蛋白经小鼠尾静脉注射体内 ,用免疫组织化学方法对小鼠组织细胞内的PTD BCR ABL融合蛋白进行检测。结果 ①表达和纯化了分子量为 2 3× 10 3的PTD BCR ABL融合蛋白 ;②在接受融合蛋白的小鼠肝、脾、肾及心肌组织的细胞内检测到了PTD BCR ABL融合蛋白 ;③接受融合蛋白的小鼠脑组织细胞中可以检测到融合蛋白的存在。结论 PTD可在体内介导较大分子量的融合蛋白进入组织细胞和通过血脑屏障 。

泛素连接酶β-TrCP降角翠BCR-ABL融合蛋白对白血病K562细胞增殖的抑制

目的:t(9;22)(q34;q11)突变导致的BCR-ABL融合基因及其编码的融合蛋白在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)发病中发挥重要作用。本研究观察可与BCR-ABL融合蛋白N端寡聚化区域(Oligomerization domain,OD)特异性结合的嵌合泛素连接酶E3 β-TrCP的β-TrCP-OD-HA的重组腺病毒载体,经泛素-蛋白酶体途径降解BCR-ABL融合蛋白对白血病K562细胞增殖的影响。方法:HEK293细胞扩增野生型Ad5β-TrCP-OD-HA、突变型Ad5ΔF-TrCP-OD-HA及空载Ad5GFP重组腺病毒载体,感染K562细胞。以未感染K562细胞作空白对照,流式细胞术检测重组腺病毒载体感染效率,Western blot检测外源性重组蛋白和BCR-ABL融合蛋白的表达,通过细胞增殖曲线、甲基纤维素集落形成试验、细胞周期检测β-TrCP-OD-HA对K562细胞增殖的影响。结果:成功建立携β-TrCP-OD-HA重组腺病毒载体的K562细胞株,重组腺病毒载体感染效率达66.4%以上,β-TrCP-OD-HA、ΔF-TrCP-OD-HA可在K562细胞中表达。三组重组腺病毒载体感染K562细胞后,Ad5β-TrCP-OD-HA组Western blot检测BCR-ABL融合蛋白含量下降;K562细胞生长和集落形成能力均受抑制;细胞周期显示S期细胞数下降至10.88%±2.42%、G_0/G_1期升高至85.6%±5.61%,与Ad5β-TrCP-OD-HA组、Ad5GFP组及对照组相比,差异具有统计学意义(P均<0.05)。结论:重组腺病毒介导的β-TrCP-OD-HA、ΔF-TrCP-OD-HA能够在白血病K562细胞中表达;β-TrCp-OD-HA可以抑制K562细胞的生长增殖,其机制可能与其降解BCR-ABL融合蛋白、阻滞细胞周期而实现。

针对bcr/abl融合蛋白的治疗研究进展

bcr/abl融合蛋白在慢性粒细胞白血病的发生与发展中扮演着重要的角色,针对bcr/abl为靶点的治疗已成为当前研究的热点。结合近年来的大量相关文献,对目前的研究现状进行综述并给予相应的评价。

bcr/abl融合蛋白对细胞DNA损伤修复功能的影响

目的:建立稳定表达bcr/ablP210融合蛋白的小鼠转化细胞株BaF3-P210的DNA损伤模型,探讨bcr/abl融合蛋白对细胞DNA损伤修复功能的影响.方法:彗星实验检测不同浓度H2O2诱导的BaF3-P210细胞的DNA损伤建立DNA损伤模型,以空载体转染BaF3-MIGR1细胞为对照;用彗星实验对两组细胞在DNA损伤后的修复进行不同时间段的动态观测.结果:彗星实验确定了细胞DNA损伤模型的建立条件是:采用50μmol/L终浓度的H2O2对BaF3-MIGR1细胞和BaF3-P210细胞进行染毒,H2O2作用温度和时间均为4℃,10min.BaF3-P210细胞与BaF3-MIGR1细胞相比DNA损伤后修复时间缩短,在损伤后60min即可达到完全修复,而后者在损伤后120min才能完全修复(P<0.05).结论:建立了表达bcr/ablP210融合蛋白的小鼠转化细胞株BaF3-P210细胞的DNA损伤模型,并发现bcr/abl融合蛋白可增强BaF3-P210细胞的DNA损伤后修复能力.

BCR/ABL融合蛋白对鞘氨醇激酶和1-磷酸鞘氨醇分泌的影响

目的研究高表达BCR/ABL融合蛋白对人鞘氨醇激酶(SPK)表达、活性及1-磷酸鞘氨醇(S1P)分泌的影响。方法使用pLXSN和pLXSN-bcr/abl的重组逆转录病毒感染HL-60和ECV304细胞并筛选出pLXSN和pLXSN-bcr/abl的细胞。利用RT-PCR鉴定病毒转染。WesternBlot检测SPK表达,γ-32P-ATP掺入法检测细胞SPK活性和培养上清的S1P含量。应用同样方法检测不同剂量Gleevec对K562细胞培养上清中S1P的影响。结果RT-PCR结果显示bcr/abl基因转染成功。高表达BCR/ABL融合蛋白的HL-60和ECV304均比转染空载体后的细胞SPK表达、活性和S1P分泌均显著提高。随着Gleevec浓度的增加,K562细胞培养上清中S1P的含量逐渐减少。结论BCR/ABL融合蛋白可提高细胞SPK表达、活性和S1P分泌。

人参皂甙Rg1对人慢性粒细胞白血病p210 bcr/abl融合蛋白表达的影响

目的:研究人参皂甙Rg1对人慢性髓细胞白血病敏感株K562细胞p210bcr/abl融合蛋白表达的影响。方法:体外培养K562细胞,经人参皂甙Rg1处理不同时间后,用流式细胞仪检测细胞凋亡;用Western印迹技术检测细胞内p210bcr/abl融合蛋白表达。结果:人参皂甙Rg1可诱导细胞凋亡,凋亡率并随时间延长而升高;人参皂甙Rg1可下调p210bcr/abl蛋白表达量,并具时间依赖性。结论:人参皂甙Rg1可通过降低p210bcr/abl蛋白水平来诱导K562细胞凋亡,达到有效抗人慢性髓细胞白血病的效果。

PTD-ABD融合蛋白对髓系白血病细胞的增殖和凋亡的影响

目的研究癌基因BCR/ABL C末端肌动蛋白结合域(actin-binding domain,ABD)蛋白对白血病细胞增殖和凋亡的影响。方法构建含有ABD基因的重组表达载体,应用蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)将蛋白转入白血病细胞内,应用Western blot与免疫荧光法确定蛋白是否进入白血病细胞,然后分别应用流式细胞仪及MTT法检测融合蛋白对白血病细胞凋亡及增殖的影响。结果成功构建PTD-ABD融合表达载体,获得高纯度PTD-ABD融合蛋白。同时构建PTD表达载体并获得高纯度表达蛋白。将PTD、PTD-ABD蛋白与白血病细胞K562、HL60共培养,Western blot与免疫荧光法确定PTD、PTD-ABD蛋白成功进入细胞内。与阴性对照比较,PTD-ABD蛋白能显著抑制HL60细胞的生长,并且对HL60细胞的凋亡具有明显的促进作用,差异具有统计学意义(P<0.05),但对K562细胞的增殖及凋亡无影响(P>0.05);PTD蛋白对K562、HL60细胞的增殖及凋亡无影响,与阴性对照比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论PTD转导的ABD蛋白抑制HL60细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。

BCR/ABL-OD结构域重组蛋白的表达和纯化

目的:制备BCR/ABL OD结构域-HIS的重组蛋 白.方法:用RT-PCR方法扩增BCR/ABL OD结构域的基因 片段,测序正确后将其克隆入原核表达载体pET16b中,并进 行酶切鉴定,鉴定正确后转化大肠杆菌BL21,构建表达His- OD融合蛋白的菌株.经IPTG诱导表达后,镍 次氮基三乙酸 (Ni NTA)琼脂糖进行亲和层析纯化,用SDS-PAGE对该融 合蛋白的表达产率及蛋白纯度进行了分析.结果:获得了 His-OD重组融合蛋白,纯度在95%以上,产物得率约75%. 结论:成功制备高纯度His-OD融合蛋白,为进一步研究OD 结构域的生物学功能奠定了基础.

bcr-abl逆转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病样模型的建立

目的：构建bcr-abl逆转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病（CML）样模型,为深入研究CML发病机制和治疗奠定基础.方法：bcr-abl逆转录病毒Mig210载体经Phoenix-Ampo细胞包装后,取上清液感染5-FU处理后的BALB/c雄性小鼠骨髓细胞,再经尾静脉移植入经致死剂量γ射线（900cGy）照射的同种雌性受体鼠中.用形态学、RT-PCR和Western Blot鉴定小鼠成模情况.结果：小鼠移植8-9 wk后,外周血白细胞达2×10^10-3×10^10/L（为对照鼠的5-8倍）,外周血涂片幼稚细胞达到0.10-0.20;骨髓粒系细胞显著增高,易见幼稚细胞,肝脾也可见白血病细胞浸润;移植4-5 wk后在受体鼠骨髓和脾脏检出bcr-abl融合基因,8-9 wk后在肝脏亦检测出bcr-abl融合基因,同时在骨髓和脾脏也检测到bcr-abl融合蛋白.建模成功的小鼠3-5 mo后相继死亡.结论：成功建立bcr-abl逆转录病毒介导的小鼠CML模型,可用于后续CML信号通路和治疗机制的研究.

抗PTD-bcr/abl单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备单克隆抗体(mAb)并初步用于PTD-bcr/abl融合蛋白的研究,为慢性粒细胞白血病的免疫治疗提供实验依据。方法:在大肠杆菌中表达PTD-bcr/abl融合蛋白,用所获得的蛋白免疫BALB/c小鼠,常规收集小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合,筛选杂交瘤细胞株的阳性克隆,并对其进行一系列鉴定。结果:(1)表达PTD-bcr/abl融合蛋白;(2)制备了抗PTD-bcr/abl融合蛋白mAb;(3)用mAb以多种方法检测PTD-bcr/abl融合蛋白,证实此抗体效价高,特异性强。结论:此抗体可用于PTD-bcr/abl融合蛋白的进一步研究。

抗PTD-bcr/abl多克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备多克隆抗体并初步用于PTD -bcr/abl融合蛋白的研究 ,为慢性粒细胞白血病的免疫治疗提供实验依据。方法 在大肠杆菌中表达PTD -bcr/abl融合蛋白 ,用所获得的蛋白免疫家兔得到多克隆抗体 ,并用免疫组化染色 ,Western -blot等方法进行此抗体的鉴定。结果 ①表达PTD -bcr/abl融合蛋白。②制备了抗PTD -bcr/abl融合蛋白多克隆抗体。③并用多克隆抗体以多种方法 ,检测PTD-bcr/abl融合蛋白 ,证实此抗体效价高、特异性强。结论 此抗体可用于PTD

PMA特异性抑制K562细胞BCR/ABL和Fyn mRNA的表达

目的:研究12-肉豆蔻酸-13-乙酸佛波酯(PMA)对K562细胞BCR/ABL与Fyn mRNA表达的影响及两者之间的关系。方法:1～250μg/L PMA刺激K562细胞24 h后,应用实时荧光定量PCR技术检测各组BCR/ABL和Fyn mRNA的水平。结果:PMA明显抑制BCR/ABL和Fyn mRNA的水平,该下调作用均具有显著的量效关系,且BCR/ABL和Fyn的mRNA表达水平下调表现出明显的相关性。比较刺激Molt-4细胞株的结果,PMA抑制作用具有细胞选择性。K562细胞株经诱导后出现伪足样的形态改变。结论:PMA通过抑制BCR/ABL融合基因的转录下调Fyn转录水平。

bcr/abl反义寡聚脱氧核苷酸抑制慢性粒细胞白血病细胞生长的研究

目的:研究bcr/ abl基因的反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASON)对K5 6 2细胞生长的影响。方法:根据bcr/ abl基因类型(b3/ a2 )的c DNA序列分析,以其m RNA融合区的18个核苷酸为作用靶序列,人工合成了18聚ASON片段,同时合成18聚无义ASON片段,作为序列特异性对照。用ASON和无义ASON片段与K5 6 2细胞共同培养,同时设置空白对照组,作用一定时间后分别测定细胞动力学、3H- Td R掺入率、bcr/ abl m RNA和P2 10蛋白的表达。结果:3.5～30 .0 μmol·L- 1的ASON对K5 6 2细胞生长有不同程度的抑制作用,ASON浓度低于10 .0 μmol·L- 1时抑制作用很小,大于10 .0 μm ol·L- 1时抑制作用显著,这种作用有浓度、时间依赖关系,而无义ASON与空白对照组比较差异无显著性(P<0 .0 5 )。同时发现ASON使细胞的3H - Td R掺入率下降,bcr/ abl m RNA及P2 10蛋白的表达下降。结论:ASON的抑制作用是从基因水平上封闭了bcr/ abl m RNA转录及P2 10蛋白的翻译,抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡。ASON对慢性粒细胞白血病(CML )细胞有抑制作用。

小檗胺诱导K562细胞凋亡及其与bcr/abl gene及P210表达的关系

目的 :探讨小檗胺 (BER)诱导K5 6 2细胞凋亡及其可能的机制。方法 :以流式细胞仪 (FCM)分析、电镜观察细胞微结构变化及基因组DNA电泳等方法检测细胞凋亡。以RT -PCR及Westernblot方法检测K5 6 2细胞BCR/ABLmRNA和蛋白质水平表达。结果 :FCM检测见到典型的凋亡峰 ,8 0mg/LBER作用 2 4 - 72h ,随药物作用时间延长 ,细胞凋亡率由 (2 9 2 0± 3 82 ) %上升至 (6 1 77± 4 35 ) % (P <0 0 1) ;以 2 0 - 8 0mg/LBER作用 2 4h ,随药物浓度增加 ,K5 6 2细胞的凋亡率也增加。电镜下可见明确的细胞凋亡的形态学改变。DNA电泳呈现典型的梯形条带。 16 0mg/LBER处理 2 4h ,K5 6 2细胞bcr/ablmRNA相对表达量及BCR/ABL融合蛋白质P2 10水平均明显低于对照组 ,分别为 0 73± 0 0 2vs 1 19± 0 0 2 (P <0 0 1)和 0 6 3± 0 0 1vs 1 0 4± 0 0 2 (P <0 0 1) ,呈时间 -浓度依赖效应。经BER作用后 ,K5 6 2细胞bcr/ablmRNA表达强度与P2 10水平呈正相关 (r =0 92 8,P <0 0 5 ) ,且细胞凋亡率与bcr/ablmRNA表达呈负相关 (r=- 0 997,P <0 0 1)。结论 :在体外BER对K5 6 2细胞有明显的促凋亡作用 。

类人慢性粒细胞性白血病小鼠模型的建立

目的：为了进一步阐明慢性粒细胞性白血病（chronic myeloid leukemia，CML）的发病机制、寻找新的治疗靶点，有必要建立CML动物模型。方法：首先改进逆转录病毒包装技术，在相同实验条件下，改变以下条件之一，如质粒的质量、包装细胞的状态、转染当天包装细胞的密度等，进行病毒滴度的测定，优化实验条件后进行后续实验。实验组为BCR／ABL（含BCR／ABL融合基因的逆转录病毒载体）组小鼠。供体小鼠经5-氟尿嘧啶（5．FU）预处理后，骨髓细胞经p210BCR／ABL逆转录病毒上清感染，感染的骨髓细胞经尾静脉注射给经致死剂量X光照射的受体小鼠。观察移植后BCR／ABL组小鼠的活动情况、发病鼠外周血和骨髓的细胞形态、肝脾病理改变等。同时观察MigRl（逆转录病毒空载体）组小鼠。结果：通过提高质粒的质量、改善包装细胞的状态、优化转染当天包装细胞的密度等，提高了病毒的滴度，用于小鼠移植模型实验。BCR／ABL组小鼠均于移植后19—25d发病死亡。发病时外周血及骨髓均见中晚幼及成熟粒细胞大量增生，肝脾肿大伴正常结构破坏及大量粒细胞浸润。MigR1组小鼠均无发病。结论：通过改进逆转录病毒包装技术，提高包装病毒的滴度，我们在体外将BCR／ABL转入小鼠骨髓细胞并移植入受体小鼠，成功建立了类人CML小鼠模型。

β-TrCP-OD-HA重组腺病毒对白血病K562细胞凋亡的影响

目的研究癌蛋白Bcr-Abl被泛素-蛋白酶体系统靶向降解的可能性及诱导白血病K562细胞凋亡的作用。方法含有Bcr-Abl融合蛋白N端寡聚化区(OD)的重组腺病毒Ad5β-TrCP-OD-HA特异性结合Bcr-Abl融合蛋白的N端寡聚化区(OD),通过感染将嵌合泛素连接酶β-TrCP运送到靶细胞K562细胞,同时,β-TrCP基因突变的重组腺病毒Ad5△F-TrCP-OD-HA和仅含绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒Ad5GFP,分别作为对照。感染后,Western blot检测Bcr-Abl融合蛋白的表达;倒置显微镜、光镜和电镜观察细胞形态学变化。结果成功建立携β-TrCP-OD-HA、△F-TrCP-OD-HA的重组腺病毒的K562细胞株,重组腺病毒感染K562细胞后,Ad5β-TrCP-OD-HA组的Bcr-Abl融合蛋白含量下降,与Ad5β-TrCP-OD-HA组、Ad5GFP组及对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);倒置显微镜可见Ad5β-TrCP-OD-HA作用后细胞体积变小、形态不规则;光镜下发现胞体变小,细胞质空泡,细胞核出现碎裂和凋亡小体;电镜观察到出现了典型的细胞凋亡的超微结构。结论重组腺病毒介导的β-TrCP-OD-HA在白血病K562细胞内能够降低Bcr-Abl融合蛋白含量,并且诱导K562细胞发生了凋亡。

趋化因子MIP-1α和MCP-1及其受体CCR-1和CCR-2在慢性髓系白血病细胞中的表达

本文旨在研究MIP-1α和MCP-1及其受体CCR-1和CCR-2在慢性髓系白血病细胞中的表达,同时观察P210bcr/abl融合蛋白中酪氨酸激酶对MIP-1α和MCP-1及其受体CCR-1和CCR-2mRNA表达的影响。在bcr/abl融合基因阴性和阳性慢性髓系白血病细胞中,采用半定量RT-PCR方法检测MIP-1α、MCP-1、CCR-1、CCR-2mRNA的表达水平。结果表明MIP-1αmRNA和CCR-1mRNA在bcr/abl融合基因阳性细胞中不表达,但在bcr/abl融合基因阴性细胞中表达,而MCP-1mRNA和CCR-2mRNA在bcr/abl融合基因阳性和阴性细胞中均不表达。当P210bcr/abl融合蛋白中酪氨酸激酶被抑制后,MIP-1α和CCR-1的mRNA表达水平恢复至正常水平。结论:P210bcr/abl融合蛋白抑制慢性髓系白血病细胞中MIP-1α和CCR-1mRNA的表达,但对MCP-1和CCR-2mRNA的表达无影响。

慢性髓系白血病细胞中SphK-1/S1P信号通路的初步研究

慢性髓系白血病(CML)是一种以髓系细胞受累为主的多能造血干细胞的克隆性疾病。为探讨SphK-1/S1P信号通路元件在CML细胞中的表达情况,研究P210bcr/abl是否涉及到SphK-1/S1P信号通路,首先采用RT-PCR检测bcr/abl阳性的K562细胞和bcr/abl阳性的原代CML细胞中SphK-1和S1P受体mRNA的表达。进一步利用P210bcr/abl特异抑制剂甲磺酸伊马替尼处理bcr/abl阳性的K562细胞和CML原代细胞,然后通过32P-ATP掺入法测定细胞内SphK-1的酶活性。结果表明:K562细胞经2.5μmol/L甲磺酸伊马替尼处理0.5、2、6、24和48小时后,对SphK-1活性抑制强度分别为0.007%、38.9%、34.6%、28.1%和76.1%;CML原代细胞在使用2.5μmol/L甲磺酸伊马替尼处理后SphK-1活性较对照下降(16.8-41.9)%。结论:CML细胞中存在SphK-1和S1P的表达,P210bcr/abl具有激活SphK-1的作用。

小檗胺对K562细胞体外及体内作用的实验研究

为了探讨小檗胺(berbamine,BER)在体外及体内抗人白血病细胞株K562细胞的作用及其可能的机制,用MTT法测定K562细胞的增殖抑制,用流式细胞术检测凋亡细胞,用RTPCR方法检测bcr/abl基因表达,用Westernblot方法检测BCR/ABL蛋白质水平表达,利用K562细胞荷瘤裸鼠模型观察小檗胺治疗后瘤体大小、组织病理及bcr/abl基因表达的改变。结果表明:小檗胺对K562细胞有明显的增殖抑制作用,呈时间浓度依赖关系。经8.0μg/mlBER作用24、48、72小时,对K562细胞的抑制率分别为(26.63±3.57)%,(61.84±4.74)%,(75.32±1.95)%,与对照组相比,P<0.01。IC50值(72小时)为(5.227±1.307)μg/ml。与空白对照组相比,经8.0μg/ml小檗胺处理72小时后,K562细胞凋亡率明显增加[(61.77±4.35)%vs(0.50±0.14)%,P<0.01]。小檗胺能下调K562细胞bcr/ablmRNA表达和P210水平,且呈浓度时间依赖效应,并与细胞凋亡率有一定的相关性。经8.0μg/mlBER处理后,与同浓度点对照组相比,72小时组的表达明显地减弱(0.97±0.01vs1.38±0.02,P<0.01)。4.0-16.0μg/mlBER处理24小时后,P210的相对表达量由未加药对照组的1.04±0.02降至16.0μg/ml组的0.63±0.01(P<0.01),与所设的对照组药物酪氨酸蛋白激酶抑制剂STI571的作用结果相似。在K562荷瘤裸鼠模型,小檗?