改良微柱凝胶法检测ABO变异型血型

目的:建立用于检测ABO变异型血型的改良微柱凝胶法。方法:选取2016年11月至2018年5月温州医科大学附属第二医院育英儿童医院、温州市人民医院和瑞安市人民医院ABO血型凝集强度改变或正反定型不一致的患者12例。采用血型血清学检查和血型基因检测结合临床表现确认标本ABO血型;对已知血型标本用微柱凝胶法复核;用1% O型、A3亚型和A抗原减弱红细胞调整微柱凝胶法离心方式建立改良微柱凝胶法,并对全部标本进行检测。结果:12例标本中A3亚型1例,B(A)型3例,类孟买型3例,ABO抗原减弱5例;微柱凝胶法和盐水试管法检测敏感度相似,12例标本中只检出2例,检出比例为2/12;选定改良微柱凝胶法的离心方式为900 r/min离心2 min、4 ℃孵育30 min、1 800 r/min离心3 min;用改良微柱凝胶法检测12例标本,1例不能检出,检出比例为11/12。结论:本研究建立的改良微柱凝胶法通过改变微柱凝胶血型卡的离心方式、增加孵育时间和孵育温度,提高了检测敏感度,适合ABO变异型血型的筛检。

ABO变异型BW.12等位基因的鉴定及序列分析

目的研究ABO基因的α-1,3半乳糖基转移酶基因变异对于B抗原表达的影响。方法在标准血型血清学方法鉴定基础上,应用聚合酶链反应-序列特异性和ABO基因第1—7外显子PCR产物直接测序进行ABO基因分型及序列分析。结果先证者血清学检测为Bw亚型,PCR-SSP结果显示标本基因型为B/O2。直接测序分析发现c.278C>T、c.297A>G、c.526C>G、 c.657C>T、c.703A>G、c.796C>A、c.803G>C和c.930G>A 8个位点突变。该序列与B.01等位基因序列比对仅在278位发生C>T的突变导致多肽链p.Pro93Leu替换。结论α-1,3半乳糖基转移酶基因278位碱基C>T突变产生BW.12等位基因。

ABO血型基因变异体引起正反定型不合1例

目的采用分子生物学技术分析ABO血型鉴定正反定型不合1例,为保障患者的输血安全提供依据。方法 ABO血型血清学鉴定采用微柱凝胶法。提取全血DNA,用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)进行ABO基因分型;用PCR法扩增ABO基因1~7号外显子进行直接测序,测序结果与A101序列进行比较。结果患者血型表现为正反定型不符,正向鉴定为O型,反向鉴定仅发现有抗-B凝集素,结果为A型。患者红细胞和抗-AB单克隆抗体有微弱的凝集。ABO PCRSSP基因分型表明患者为杂合O1/A基因型,进一步对外显子扩增测序发现ABO第6外显子存在248A>G误义突变,导致糖基转移酶83位天冬氨酸被甘氨酸替代(Asp83Gly)。用自行设计的引物采用PCR-SSP法对350例献血者进行248A>G突变频率调查,未发现阳性。结论 ABO基因248A>G变异体和缺乏抗-A凝集素以及A抗原极低水平表达相关。

疑难血型标本的基因测序分析

目的采用基因测序方法鉴定8例ABO、Rh血型不符的疑难血型。方法收集本院2019年12月至2023年4月血型正反定型不符的8例血液标本,采用基因测序方法检测基因型。结果基因测序结果显示:8例样本中1例为A102/O01、1例为Bw12/O01、1例为B(A)、1例为O01/O02、1例为Bw19/O01、2例为类孟买、1例为weak D type 25/RHD*DEL1。其中有6例标本血型基因测序结果和血清学表型一致,2例标本的血清学表型和基因测序结果均表现出一定的差异。结论基因测序技术可以很好地解决输血患者抗原或抗体减弱以及亚型所致的ABO血型正反不符的血型鉴定,并鉴定了1个罕见的RhD变异型,可提升输血安全性,保证临床用血安全。

中国人罕见的cisAB变异型分子机制分析

为研究中国人群ABO血型系统中罕见的cisAB变异型的分子遗传背景,用血型血清学方法鉴定12例ABO血型疑难样本和116例随机无血缘关系样本,应用聚合酶链反应和DNA序列分析等方法对样本ABO基因酶活性编码区外显子6、7和侧翼内含子进行突变筛选和检测,并对不同基因型的扩增片段进行单倍体序列分析。血清学检测发现12个样本均为(A强B弱)或(A弱B强),PCR产物直接序列分析表明这些样本均为cisAB变异型,并存在4种基因型。通过单倍体序列分析,从中发现2种cisAB等位基因,其中cisAB01不仅存在外显子7的467C>T和803G>C变异,还在第6内含子存在未经报道的163T>C和179C>T变异;另一种等位基因是在B101基础上保留了A101的803G位点,编码一条176G、235S、266M和268G组合的多肽链。经检索,未发现该组合的ABO等位基因,该等位基因已被国际血型抗原基因突变数据库命名为cisAB05等位基因。文章系统研究了中国人群cisAB变异型分子机制,发现了一种新的cisAB05等位基因,同时根据内含子序列推测cisAB01等位基因可能是通过A101和B101等位基因间的同源交换而形成的。

α-1,3半乳糖胺基转移酶基因变异致Bw亚型一个家系的遗传学分析

目的探讨1个Bw亚型家系的血清学和基因序列特征。方法选择2020年12月10日在解放军联勤保障部队第九六〇医院输血医学科进行孕前检查的1名32岁女性先证者及其5名家系成员作为研究对象。用血清学方法进行ABO血型表型的检测和ABO血型基因分型。通过对先证者ABO基因第1~7外显子直接测序及单体型分析。结果先证者血型血清学表现为Bw,荧光PCR检测ABO血型的基因型为B/O。直接测序的结果显示,先证者符合ABO*O.01.01/ABO*B.01基因型,同时携带c.1A>G变异。经克隆测序,c.1A>G变异发生在ABO*B.01等位基因上。家系调查发现,先证者母亲的血型为O型,丈夫为B型,3名子女的血型为正常的B型,基因测序显示,先证者2个儿子的血型基因包含该变异,基因型为ABO*B.01with c.1A>G/ABO*B.01,先证者女儿的血型基因型为ABO*O.01.01/ABO*B.01,母亲为ABO*O.01.01/ABO*O.01.02。结论α-1,3半乳糖胺基转移酶基因第1外显子c.1A>G可导致B抗原表达减弱,考虑为先证者血型为Bw亚型的原因。

三例罕见ABO变异型Bw亚型的基因鉴定及序列分析

目的对3例ABO变异型Bw亚型进行基因鉴定及序列分析。方法采用常规血清学检测ABO血型,并应用Sanger测序进行ABO基因鉴定。结果3例ABO血型鉴定均符合Bw亚型,基因分型分别为ABO*Bw.11/0.01.02、ABO*Bw.12/0.01.01、ABO*Bw.34/A1.02,测序发现分别存在c.695T>C变异致多肽链Leu232Pro替换,c.278C>T变异致多肽链Pro93Leu替换,c.889G>A变异致多肽链Glu297Lys替换。结论本研究分别发现了Bw11、Bw12、Bw34亚型各一例。基因检测可作为血清学结果的补充确定ABO血型的亚型。

一例ABO变异型Bw37等位基因的鉴定

目的对一例罕见的ABO变异型Bw37等位基因进行鉴定及测序,探讨其分子机制。方法采用试管凝集法鉴定ABO正反血型,用序列特异性引物-聚合酶链反应(polymerase chain reaction-sequence specific primer,PCR-SSP)法进行ABO基因分型,直接测定ABO基因第6、7外显子的核苷酸序列并对结果进行分析。结果先证者血清学鉴定ABO正定型为B弱、反定型为B型。ABO基因分型为B/B。第6、7外显子测序提示存在c.297A>G、c.526C>G、c.657C>T、c.703G>A、c.796 C>A、c.803G>C、c.930G>A变异,导致p.R176G、p.G235S、p.G268A氨基酸改变。ABO血型基因型为ABO*Bw37/B101。其母亲ABO正反定型均为O型,ABO血型基因型为ABO*O.01.02/ABO*O.01.01。结论采用常规血型血清学结合基因分型技术对一例ABO亚型Bw37进行了鉴定。

α1,3半乳糖基转移酶新等位基因278C>T的鉴定

目的研究中国汉族人群ABO血型系统中Bw变异型的分子遗传背景,发现并鉴定一个新的ABO等位基因。方法血型血清学方法鉴定1例ABO血型疑难样本,应用聚合酶链反应、逆转录-聚合酶链反应和DNA序列分析等方法对先证者ABO基因转录调控序列和全编码序列进行突变筛选和检测。结果血清学和家系调查鉴定该样本为Bw表型,对gDNA和cDNA研究发现该样本存在第6外显子278C/T杂合,单倍体分析发现一种新的Bw等位基因,该等位基因与B101相比,差异仅在第6外显子的278C>T错义突变,导致多肽链P93L替换,该突变点位于以前报道的Bw等位基因功能域之外。结论在中国人群中发现一种新的导致Bw变异型的ABO等位基因。

一种新的B3变异型相关的B糖基转移酶基因M142T突变研究

目的研究中国人个体ABO血型系统中具有混合外观凝集特征的B3变异型的分子遗传背景。方法血型血清学方法鉴定2例ABO血型疑难样本的红细胞表型，应用连续凝集方法和13个短串联重复序列（short tandem repeat，STR）位点检测法，排除外源性或内源性DNA嵌合的可能。对ABO基因第6、7外显子和部分内含子进行聚合酶链反应和DNA序列分析，并进一步通过克隆测序法鉴定2个样本的ABO基因单倍型。结果2个无关个体红细胞与抗-B和抗-AB发生混合外观凝集，连续凝集法和STR检测排除了样本的外源性DNA污染和内源性遗传嵌合子，根据血清学特征确定这2个个体红细胞均为A1B3血型。单倍型序列分析发现2个样本为A1B杂合子，其中B等位基因与B101相比，差异仅在第7外显子的425T〉C错义突变，导致B糖基转移酶多肽链M142T替换。结论在中国人群中发现一种新的可能导致B3变异型的ABO等位基因。

一例B糖基转移酶基因缺失导致Bel变异型的分子机制

目的探讨1例ABO血型Bel变异型的分子机制。方法血清学方法检测样本的红细胞和血清；用PCR扩增其ABO基因的全部外显子及侧翼的内含子序列，并进行双向测序。通过克隆进行单体型分析，并模建分析其糖基转移酶的三维结构。结果吸收放散实验检出样本红细胞上有表达极弱的B抗原，血清学表现为Bel。直接测序分析发现ABO基因第6外显子261del／G杂合，第7外显子297A／G、484del／G、526c／G、657C／T、703G／A、796C／A、803G／C、930G／A杂合。单倍型克隆测序发现有1个O01等位基因和1个新的B等位基因。与B101参考序列相比，新的B等位基因序列中存在484delG，并被红细胞血型抗原基因突变数据库（dRBC NCBI）命名为B120。484delG可导致B糖基转移酶阅读框发生改变而提前终止，三维结构分析显示其蛋白仅保留部分N端结构区域，为不完整的转移酶蛋白。结论B转移酶基因第484位缺失G可引起酶活性缺失或显著减弱，从而导致Bel表型。

一种ABx变异型相关的B糖基转移酶基因新突变研究

目的研究1例ABO血型系统ABx变异型的分子遗传背景。方法用血型血清学技术鉴定1例AB0血型疑难样本的红细胞表型和唾液血型分泌物质，并用聚合酶链反应分别扩增先证者ABO基因全编码区共7个外显子及侧翼内含子序列，扩增产物经双酶切纯化后直接进行双向测序分析。进一步对存在突变位点的第6～7外显子扩增产物经进行TA克隆和单倍体序列分析。结果先证者红细胞ABO抗原表达为A强B弱，结合其它血清学特征，鉴定其血型为罕见的ABx变异型。ABO基因全编码区测序发现9处核苷酸杂合位点，分别为第6外显子的297A／G杂合，第7外显子的467C／T、526C／G、657C／T、703G／A、796C／A、803G／C、808T／A、930G／A杂合。单倍体序列分析发现，其中一个等位基因为常见的A102，另一个等位基因除808T〉A突变外，其它变异位点与B101等位基因一致。808T〉A突变可导致B糖基转移酶第270位苯丙氨酸转变为异亮氨酸。结论B糖基转移酶基因808T〉A突变可能引起酶活性减弱，并进而导致产生Bx变异型。

α-1,3- N-乙酰半乳糖胺基转移酶基因新变异的家系研究

目的通过对一例ABO亚型家系血清学和基因序列分析,研究该家系中α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶基因新变异位点的特征。方法收集先证者及其3名家系成员血液标本,血清学方法进行ABO表型检测,荧光PCR进行ABO血型基因分型。通过对先证者ABO基因全编码区直接测序及第6、7外显子克隆测序方法进行基因序列及单体型分析。结果先证者血型为AxB亚型,ABO血型基因分型为A/B。克隆测序结果显示A新等位基因在ABO*A1.02序列基础上存在第7外显子c.797_798 insT变异。家系调查发现,先证者及其姐姐新变异均遗传自其父亲。c.797_798insT新变异序列已注册基因数据库(MK125137)。结论α-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶基因第7外显子c.797_798insT新变异为可遗传变异,可导致A抗原表达减弱。