Bcl-2抑制剂ABT-263对鼻咽癌细胞5-8F增殖和凋亡的影响

目的研究B细胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)抑制剂ABT-263对鼻咽癌细胞5-8F增殖和凋亡的影响。方法采用细胞计数试剂盒8检测不同浓度下Bcl-2抑制剂ABT-263对鼻咽癌细胞5-8F增殖的影响; Annexin V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染法检测不同浓度ABT-263对鼻咽癌细胞5-8F凋亡的影响;应用免疫印迹法检测抑制剂ABT-263对Bcl-2、Bcl-xL、髓细胞白血病1(Mcl-1)及佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯诱导的蛋白质1(又称Noxa)等蛋白表达水平的影响。结果 Bcl-2抑制剂ABT-263处理细胞后,0. 125、0. 25、0. 5、1、2、4、8μmol/L组吸光值低于0μmol/L组(0. 696±0. 020,0. 527±0. 015,0. 465±0. 022,0. 323±0. 010,0. 133±0. 004,0. 057±0. 002,0. 028±0. 002比0. 856±0. 017)(P <0. 05)。在0. 5μmol/L浓度下诱导约6%鼻咽癌细胞的凋亡,其诱导凋亡的机制可能主要是通过正调控促凋亡蛋白Noxa完成的,在1μmol/L ABT-263的作用下能够引起鼻咽癌细胞中Noxa近7倍左右的升高。结论 ABT-263可以通过上调促凋亡蛋白Noxa促进鼻咽癌细胞的凋亡,具有应用于鼻咽癌治疗的潜力。

ABT-263对顺铂耐药食管癌细胞的抑制作用

目的研究ABT-263对顺铂耐药食管癌细胞EC109/CDDP的作用。方法采用MTT法检测ABT-263对耐药细胞EC109/CDDDP及其亲代细胞EC109的细胞毒作用;通过克隆存活实验检测ABT-263对食管癌细胞再生能力的影响;流式细胞术检测细胞凋亡的情况,并通过Western blot检测细胞PARP蛋白的变化。结果 MTT实验结果显示ABT-263对EC109及EC109/CDDP的细胞活力均有显著抑制作用;克隆存活实验结果显示ABT-263可以抑制食管癌细胞的再生能力(P <0.01);流式凋亡结果分析显示ABT-263诱导食管癌细胞发生细胞凋亡(P <0.01);Western blot结果显示ABT-263显著上调细胞PARP蛋白的剪切(P <0.05或P <0.01)。结论ABT-263抑制食管癌EC109/CDDP细胞及其亲代细胞EC109的细胞活力和增殖能力,诱导细胞发生凋亡。

ABT-263中间体羧酸片段合成研究

报道了Bcl-2家族蛋白抑制剂ABT-263(1)中间体羧酸片段即4-(4-((2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基环己基-1-烯)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸(2)的合成方法。首先4,4-二甲基环己酮与三溴化磷和N,N-二甲基甲酰胺反应生成第一个中间体化合物2-溴-5,5-二甲基环己基-1-烯甲醛(3),经Suzuki偶联反应,还原、卤代、胺化,最后经水解、酸化得到目标产物(2)。经过6步反应,使用廉价易得的原料和试剂,反应条件温和,后处理方便,纯化方法简单,总产率达到48.0%,明显高于现有文献报道产率,适合大规模生产。各步反应产物结构经过1H NMR确认。

衰老细胞清除剂ABT-263联合替莫唑胺治疗胶质母细胞瘤增敏作用及机制

目的探究衰老细胞清除剂ABT-263联合替莫唑胺(TMZ)治疗胶质母细胞瘤的效果及作用机制。方法体外培养U87MG细胞系,分为对照组(不进行干预)、TMZ组和TMZ+ABT组。应用SA-β-gal染色检测细胞的衰老;应用MTT法检测细胞活力;应用EdU染色检测细胞增殖能力;应用划痕试验检测细胞迁移能力;应用蛋白印迹法检测不同药物处理组U87MG细胞中P53、P21、Bcl-2、Bax、PARP1和Caspase3等蛋白的表达量。应用转录组测序分析不同药物治疗组中U87MG细胞基因的表达差异。结果与TMZ(200μmol/L)组相比,TMZ(200μmol/L)+ABT(2μmol/L)组细胞衰老率显著下降(P<0.05),EdU阳性细胞比例显著降低(P<0.05),细胞迁移速率显著减慢(P<0.05)。与相同TMZ剂量单药给药组相比,TMZ(10μmol/L)+ABT(2μmol/L)低剂量组、TMZ(50μmol/L)+ABT(2μmol/L)中剂量组、TMZ(200μmol/L)+ABT(2μmol/L)高剂量组细胞P21蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),细胞Bcl-2和Caspase3蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05);低剂量联合给药组细胞P53蛋白表达水平显著降低(P<0.05),中、高剂量联合给药组细胞PARP1剪切体蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),中、低剂量联合给药组细胞Bax蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。此外,TMZ(100μmol/L)+ABT(1μmol/L或2μmol/L)组和TMZ(100μmol/L)组相比,显著改变的差异表达基因共有312个,其中上调基因141个,下调基因171个,富集分析涉及多条炎症反应以及调控细胞过程相关的通路。结论ABT-263联合TMZ可以抑制U87MG细胞的增殖和迁移,在一定程度上清除由TMZ诱导的U87MG衰老细胞,干扰生长停滞肿瘤细胞的恢复能力,防止肿瘤复发。

ABT-263诱导A431细胞凋亡及其对AKT下游信号通路影响

目的观察抗凋亡蛋白抑制剂ABT-263对人皮肤鳞状细胞癌细胞系A431细胞功能的影响,并探讨相关分子机制。方法 (1)取对数生长期的人永生化表皮细胞(Ha Ca T细胞)与A431细胞提取总蛋白,采用蛋白印迹法检测B淋巴细胞瘤-2(BCL-2)和BCL-XL的蛋白表达水平。(2)分别以浓度为50μmol/L的ABT-263(抑制剂组)和二甲基亚砜(对照组)处理A431细胞,培养4和9 h后,采用透射扫描电子显微镜(TEM)检测各组细胞的形态变化。(3)以剂量为0、10、25、40和50μmol/L的ABT-263处理A431细胞24 h后,采用CCK-8法检测细胞活力。(4)以不同剂量的ABT-263处理A431细胞,采用蛋白印迹法检测活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)、活化聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1(PARP-1)、磷酸化蛋白激酶B(p AKT)ser473、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(p GSK3β)和磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)的蛋白相对表达水平。结果 A431细胞中的BCL-2和BCL-XL蛋白相对表达水平均高于Ha Ca T细胞(P<0.01)。TEM检查结果显示,抑制剂组A431细胞从正常的形态逐渐变化为凋亡的形态,表现为微绒毛消失,核染色质密度增高并凝聚在核膜周边,核仁裂解。10、25、40和50μmol/L剂量组A431细胞的细胞活力均低于对照组(P<0.05)。10、30和50μmol/L剂量组A431细胞的活化Caspase-3和活化PARP-1蛋白的相对表达水平均高于对照组(P<0.05)。10、25、40、50μmol/L剂量组A431细胞的p AKT(ser473)和p GSK3β的蛋白相对表达水平均低于对照组(P<0.05),γH2AX蛋白相对表达水平高于对照组(P<0.05)。A431细胞活力和p GSK3β蛋白相对表达水平均随抑制剂剂量的增加而减少(P<0.01),活化Caspase-3和γH2AX的蛋白相对表达水平均随抑制剂剂量的增加而增加(P<0.01),均呈剂量-效应关系。结论 ABT-263可诱导A431细胞发生线粒体途径的凋亡,并可诱导AKT/GSK3β信号通路失活,从而促进A431细胞凋亡,呈一定程度的剂量-效应关系。