应用单克隆抗体AC-ELISA检测鸡蛋卵黄中鸡毒支原体

采用抗鸡毒支原体阳性血清包被酶标板作为捕捉抗体 ,以 4株鸡毒支原体特异单克隆抗体作为第二抗体和酶标羊抗鼠IgG作指示抗体建立了一种检测鸡蛋卵黄中鸡毒支原体的双夹心AC_ELISA。该法具有简便、灵敏、快速等优点 ,从采样到获得结果 6小时内完成。检出率高于分离培养法 ,且重复性良好。该方法的建立为鸡群鸡毒支原体感染的检测和净化提供了一种新的可靠方法。

T. pyogenes PLO蛋白单克隆抗体的制备与AC-ELISA方法的建立

为了建立可以定量检测化脓隐秘杆菌(T.pyogenes)培养上清液中PLO蛋白含量的方法,试验首先制备针对毒力蛋白PLO分子第4结构域(D4)的单克隆抗体,然后应用筛选出的最佳捕获抗体,并结合辣根过氧化物酶(HRP)标记的靶向PLO分子第2结构域(D2)的单克隆抗体(HRP-AP-1A3)建立一种用于检测PLO蛋白含量的抗原捕获ELISA(AC-ELISA)方法,计算该方法的检测线,选择8种非T.pyogenes菌株验证该方法的特异性,绘制AC-ELISA方法的标准曲线,并应用该方法定量检测T.pyogenes HLJ-0912菌株培养上清液中wtPLO蛋白含量。结果表明:通过制备获得的5种单克隆抗体2G3、3G10、4C9、3C8、3C7对PLO蛋白均具有良好的特异性,其中单克隆抗体2G3、3G10、4C9、3C8是IgG2b亚型,均具有较强的抗溶血活性,靶向表位1(VEAGEATGLAWDPWWT);而单克隆抗体3C7是IgG1亚型,抗溶血活性非常弱,靶向表位2(KGTTLNPWVEDNVKS)。筛选出的最佳捕获抗体为单克隆抗体2G3,建立的AC-ELISA方法的最低检测限(OD_(450)值)为0.19。应用建立的AC-ELISA方法检测T.pyogenes HLJ-0912菌株的培养上清液为阳性,OD_(450)值为0.21;检测8种非T.pyogenes菌株的培养上清液均为阴性,OD_(450)值<0.19。标准曲线的方程为y=809.04x^(2)-85.695x,相关系数(R^(2))为0.999,拟合度较高。经AC-ELISA方法测定,在10,12,14小时时采集的T.pyogenes菌株培养上清液的OD_(450)值均高于最低检测限,培养上清液中的wtPLO蛋白含量分别为416.67,499.43,272.57 ng/mL。说明试验成功制备了针对PLO分子第4结构域的单克隆抗体,建立的AC-ELISA方法具有良好的特异性。

Development of a Polyclonal Antibody-based AC-ELISA and Its Comparison with PCR for Diagnosis of Canine Parvovirus Infection

A polyclonal antibody-based antigen-capture ELISA （AC-ELISA） has been developed for detection of Canine parvovirus （CPV） antigens in faecal samples of dogs. The assay uses rabbit anti-CPV polyclonal antibody as the capture antibody, guinea pig anti-CPV polyclonal antibody as tracing antibody and anti-guinea pig HRPO conjugate as the detection system. The optimum dilution of the capture antibody and the tracing antibody capable of detecting the CPV-2 antigens was found to be 1：1 600 and 1：400, respectively, in the check-board titration. In this study, a total of 152 samples （129 faecal samples and 23 cell culture supernatant） were tested both by AC-ELISA and by polymerase chain reaction （PCR）. Of the samples tested, 69 and 78 samples were found positive by AC-ELISA and PCR, respectively. The AC-ELISA had relative sensitivity, relative specificity and accuracy of 88.4%, 100.0% and 91.4% respectively. The analytical sensitivity of AC-ELISA was estimated to be 102.8 TCID50/mL whereas PCR sensitivity was 100.8 TCIDs0/mL. The AC-ELISA is a simple, quick and reliable method for screening large numbers of faecal samples of dogs suspected of CPV infection.

应用Mab-basedAC-ELISA法对鸡IBDV分离株的抗原特性分析

为了解传染性法氏囊病病毒(IBDV)的抗原变异分子基础,采用Mab-based AC-ELISA方法,利用11株单抗对2株河北IBDV分离株进行了抗原特性分析,并比较了超强毒株和弱毒株的VP2高变区序列的分子特征。结果显示:强弱毒株的抗原位点结合单抗的能力明显不同,除了Mab3、Mab9外,其余9个单抗的结合能力,超强毒株要高于弱毒株。超强毒株HeB-lf缺少了Mab3结合位点,弱毒株HeB-bdjz缺少了Mab3、Mab6结合位点,这说明强弱毒株不仅在序列上有差异,而且在抗原位点的缺失上也存在差异。本试验为控制IBD和疫苗改进具有重要意义。

抗传染性法氏囊病病毒单克隆抗体的研究 Ⅱ．AC─ELISA方法的建立

将所制备的腹水单抗ＡＢ７、ＢＧ９经硫酸铁盐析、透析，再经ＤＥＡＥ－纤维素柱层析纯化后，采用戊二醛二步法用辣根过氧化物酶标记单抗，建立了用于鉴别传染性法氏囊病病毒抗原型的ＡＣ－ＥＬＩＳＡ方法，并对国内的６个分离株及美国变异株１０８４Ａ进行了检测，结果表明，上述国内分离株均含有ＣＪ８０１株相一致的ＡＢ７、ＢＧ９位点，而１０８４Ａ株缺失ＡＢ７位点。

巨细胞病毒感染捕获ELISA分析方法的建立和应用

目的 :建立CMVIgM抗体捕获ELISA法并用聚合酶链反应 (PCR)技术对此方法进行了评价。方法 :采用巨细胞病毒 (CMV)AD— 16 9株感染人胚肺细胞的方法制备CMV抗原 ,并采用冻化抗原制备法及甘氨酸法制备抗原 ,羊抗人IgM (μ链 )McAb包被酶标板 ,建立CMVIgM抗体捕获ELISA法。结果 :不同浓度抗 μ链McAb包被 ,包被时间、包被液、封闭液等不同条件 ,以及抗原浓度、抗CMV抗体酶结合物浓度对此法的建立有不同的影响。PCR法与用最佳条件配盒后的本方法CMVIgM抗体检出率无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论 :本法测定CMV—IgM抗体的敏感性和特异性较高 ,简便、适用 ,易于推广 。

鸡传染性法氏囊病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立及应用

为快速检测鸡传染性法氏囊病毒,使用纯化的鸡抗IBDV多克隆抗体和鼠抗IBDV单克隆抗体,建立了抗原捕获ELISA检测鸡传染性法氏囊病毒的方法。使用建立的方法可以检测到1∶160倍稀释的IBDV疫苗及阳性法氏囊组织中的病毒。检测禽流感、新城疫、鸡传染性支气管炎病毒及沙门氏菌、葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎球菌等结果均为阴性。检测IBDV超强毒和疫苗毒人工感染鸡的法氏囊、脾、肝及临床样品78份,检出阳性24份,与RT-PCR检测结果相符率为96%(75/78)。说明建立的方法敏感、特异,可用于法氏囊病的诊断和监测。

鸡传染性法氏囊病病毒单克隆抗体的应用

通过中和试验证明 ,B34腹水单克隆抗体中和 IBDV CA株的中和效价高达 1∶42 0 0 0 0。经 1 0倍稀释后 ,能等量中和含毒量为 1 0 6.62 5TCID50 /ml的 IBDV CA株细胞毒。利用 B34腹水单克隆抗体建立了 MAb- AC- ELISA,可用于测定 IBDV CA株细胞毒的病毒含量 ,与 TCID50之间的相关系数为 0 .

蓝舌病病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立

为建立蓝舌病病毒（BTV）病原学检测方法,本研究以纯化的BTV-1免疫绵羊和兔子,制备高免血清。以绵羊抗BTV血清为捕捉抗体、以兔抗BTV血清和羊抗兔Ig G-HRP为检测抗体建立了检测BTV的抗原捕获ELISA（AC-ELISA）方法。该方法能够特异性检测BTV,对羊痘病毒、赤羽病病毒无交叉反应,与鹿流行性出血热鸡胚样品有微量交叉反应,但样品OD450nm/阴性对照OD450nm低于阴阳性临界值,不影响结果判定;敏感性试验检测结果表明该方法可以检出102.79 TCID50的病毒;批内和批间重复性试验变异系数分别为1.44%~8.46%和2.26%~12.44%;采用该方法与RT-PCR方法对60份鸡胚样品进行检测,阳性符合率为90%。本研究建立的AC-ELISA方法为BTV抗原检测提供了一种快速、实用的技术手段。

糖原磷酸化酶同工酶BB测定方法的建立及其在急性冠脉综合征诊治中的价值

[目的]分离纯化糖原磷酸化酶同工酶BB(GPBB), 建立血清GPBB定量测定方法,探讨其在急性冠脉综合征早期诊断及治疗中的价值.[方法] 应用纯化GPBB抗原及其抗体建立GPBB定量测定方法.对34例健康人、28例不稳定心绞痛(UAP)患者和29例急性心肌梗死(AMI)患者分别进行血清GPBB、CK、CK-MB及cTnI测定.[结果] GPBB被纯化100倍,比活性384 μmol/mg*min-1,回收率28%.建立了GPBB定量测定方法,确定抗原检测线性范围为0.3～20 ng.在AMI发作6 h内,患者血清中(n=26)GPBB浓度超过正常上限值7.4 μg/L.GPBB诊断灵敏度是89.7%,明显高于CK、CK-MB(24.1%,20.8%,P<0.01),与cTnI相当.AMI患者血清GPBB峰值水平(66.38±27.41μg/L)明显高于健康人(2.57±1.61) μg/L,P<0.01.28例UAP患者中21例血清GPBB升高≥7.4 μg/L,其均值是(23.2±14.2) μg/L,明显高于健康人和稳定心绞痛患者血清GPBB水平(P< 0.01),与cTnI诊断阳性率相似,而UAP患者血清中CK、CK-MB均无明显升高.其中GPBB升高组 (≥7.4 μg/L)4周内发生心性事件远高于GPBB<7.4 μg/L组(47.6%,14.3%,P<0.01).AMI患者血清GPBB到达峰值时间早于CK和CKMB达到峰值时间.[结论]GPBB是AMI发作后6 h内敏感特异的生化指标,对判断UAP预后有一定的临床价值.

巨细胞病毒IgM抗体捕捉ELISA法的建立及其应用

建立巨细胞病毒（ＣＭＶ）ＩgＭ抗体捕捉ＥＬＩＳＡ法（ＡＣ－ＥＬＩＳＡ），并用该法 调查１９１７例杭州市不同人群的巨细胞病毒感染情况。结果显示：抗原浓度、抗ＣＭＶ抗体酶结合物浓度对所测得的标本ＯＤ值都有不同程度的，用最适的实验条件建立的ＡＣ－ＥＬＩＳＡ法检测杭州市不同人群，表明儿童组ＣＭＶ感染率高于成人组，工人组的感染率高于其他职业人群。以本方法测定ＣＭＶ－ＩgＭ抗体的敏感性和特异性较高。

模拟抗原(Ac-NK16-Ahx-3)免疫反应抗体ELISA检测方法研究

为满足实验室单克隆抗体的制备研究,本实验特对实验室常用的制备单抗的模拟抗原(Ac-NK16-Ahx-3)进行ELISA间接法检测,进而建立一种高效的检测方法。通过对不同稀释度待测抗体的免疫吸附测定,检测出它的最终灵敏度为0.078mg/mL,最佳二抗稀释倍数为300倍,其最佳拟合曲线为y=-0.0732x+0.6875,R2=0.8619。并且,通过统计学方法进行统计分析,确定出各实验组的相关性及变异系数,从而排除实验中的操作误差,最终可确定最佳的实验条件,并保证实验的准确性。

mCry1Ac基因在抗虫转基因玉米Bt799中的表达特征

采用双抗夹心酶联免疫法(ELISA)定量检测转mCry1 Ac基因抗虫玉米Bt799在不同生育期不同植株部位的mCry1Ac蛋白含量。结果显示:mCry1 Ac基因在整个生育期玉米叶、茎、根和种子中均能表达,mCry1Ac蛋白含量为(0.82±0.10)^(15.83±1.77)μg·g-1;随着生育期和植株部位的不同,mCry1Ac蛋白含量呈现明显的时空动态变化,其中,叶、茎和根中mCry1Ac蛋白含量随转基因玉米生育期的推移均呈增加趋势,并均在完熟期达最高;在除苗期外的其他各生育期叶中mCry1Ac蛋白含量均显著高于其他植株部位,而在完熟期种子中mCry1Ac蛋白含量在各植株部位中最低,为(2.86±1.71)μg·g-1。

IBD单抗快速诊断试剂盒

河南省农科院畜牧兽医研究所张改平等,以传染性法氏囊病病毒(IBDV)的鸡法氏囊组织制备免疫抗原,免疫BALB/C系小鼠,取其脾细胞与NSO浆细胞进行细胞融合;以AC-ELISA筛选阳性细胞克隆,经3次有限稀释克隆化及鉴定,获得2株识别IBDV不同抗原决定簇的高亲和力单克隆抗体株。以该2株单克隆抗制备快速诊断试剂,组装了鸡IBD快速诊断试剂盒。

重组人巨细胞病毒(HCMV)优势表位嵌合抗原的构建表达以及捕获法检测IgM抗体

通过计算机软件分析选择巨细胞病毒优势抗原表位,用聚合酶链式反应(PCR)扩增优势表位基因,构建了巨细胞病毒多优势表位嵌合抗原表达载体p4T-UL32-UL44-UL80a-UL83,转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,GST亲和层析法获得高纯度嵌合抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记嵌合抗原,并构建捕获法检测血清中的抗HCMVIgM抗体。结果表达的优势表位嵌合抗原具有很好的抗原性,用其建立的捕获法检测确诊的30份阳性和63份儿童阴性血,阳性检出率和阴性检出率都是100%说明用嵌合抗原构建的捕获法检测血清中抗HCMVIgM抗体具有更高的灵敏度和检出正确率,其检测水平已经达到国外的同类产品水平。

IgM捕获ELISA应用于婴幼儿急性下呼吸道病毒感染早期诊断

利用抗人IgM μ链单克隆抗体和羊抗人IgMμ链抗体作为捕获抗体,建立了检测呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(AdV)和副流感病毒(PFV)抗体IgM的5层捕获ELISA方法。本法特异性好,较间接ELISA法敏感。用以检测RSV、PFV、AdV的抗体IgM与患儿血清IgG类抗体4倍增高的符合率较高。呼吸道分泌物抗原检测阳性者,血清RSV-IgM阴性率86.67％(13/15);PFV-IgM阳性率76.47％(13/17)。RSV、PFV、AdV感染发病后5天,IgM检出率均达70％以上。同时观察到RSV再次感染其IgM抗体有可能反应加强。本文认为5层捕获ELISA法对RSV、PFV和AdV急性下呼吸道感染是可靠的诊断方法之一。

基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定

【目的】通过设计并优化生物素-亲和素标记磁珠筛选策略,建立针对Cry1Ac毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法,为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法,经过4轮筛选后,对每轮筛选后抗Cry1Ac毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定,通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Cry1Ac的阳性克隆,并对其进行PCR鉴定和DNA测序,确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。利用纯化后的scFv-A12作为"捕获抗体",Anti-Cry1Ac兔多克隆抗体作为"检测抗体",建立针对Cry1Ac的双抗夹心ELISA检测方法。【结果】以生物素化的Cry1Ac蛋白为包被原,利用噬菌体抗体库对其进行了4轮液相筛选。结果显示,相对产出率随着筛选轮数的增加而提高,第4轮较第1轮提高了42倍;单克隆噬菌体ELISA鉴定抗Cry1Ac噬菌体抗体,以试验孔OD450/阴性孔OD450大于2.1为阳性标准,从第4轮筛选后的培养皿中随机挑选了300个菌落,经单克隆ELISA鉴定出6个阳性克隆,分别命名为hsCry1Ac-C5、hsCry1Ac-D8、hsCry1Ac-C12、hsCry1Ac-A12、hsCry1Ac-F9和hsCry1Ac-F4。其中,hsCry1Ac-A12具有相对较高的亲和力。对上述6个阳性克隆进行菌液PCR检测发现,在935 bp处均有明显的目的条带,通过对其进行测序和氨基酸序列比对,最终得到4株不同氨基酸序列的阳性克隆。hsCry1Ac-A12在成功替换宿主菌HB2151后,经1 mmol·L-1 IPTG诱导表达,于30℃条件下培养过夜。其表达产物经His Trap HP镍亲和柱纯化后SDS-PAGE检测,hsCry1Ac-A12蛋白分子量约为30 kD。通过方阵滴定对抗体浓度进行优化后,利用单链抗体为"捕获抗体",多抗为"检测抗体",建立了Cry1Ac双抗夹心ELISA检测方法。在1.25—2.43μg·mL-1线性检测范围内,线性回归方程为Y=0.2522X+1.2832(R2=0.9564),检测限为1.08 ng·mL-1。【结论】利用磁珠液相筛选方法,建立了针对Cry1Ac毒素的双抗夹心ELISA检测方法,为快速、准确检测转基因食品中Cry1Ac提供了一种新的检测模式。

猪源粪肠球菌Ace蛋白间接ELISA方法的建立与应用

根据GenBank已发表粪肠球菌Ace基因(AF260879)的核苷酸序列设计1对引物,通过PCR扩增Ace基因保守序列A片段部分序列,将其克隆到pET-32a(+)裁体中,构建了原核表达载体pET-32a(+)-Ace,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,成功表达并纯化了重组蛋白;以此重组蛋白作为抗原建立了检测粪肠球菌Ace抗体的间接ELISA方法。经反复试验,确定该间接ELISA的最佳反应条件为:抗原包被浓度为1mg/L,被检血清稀释度为1∶800,1%BSA为封闭液,血清和二抗的作用时间均为60min,底物TMB反应时间为15min,反应的阳性判定值为0.126。交叉试验、批内重复和批间重复试验证明,所建立的间接ELISA方法具有特异性高、重复性好的特点,可用于粪肠球菌Ace蛋白血清抗体的检测。

流行性出血病病毒抗原捕获ELISA方法的建立

为建立流行性出血病病毒(EHDV)病原学检测方法,本试验用纯化处理的4种血清型病毒(EHDV-2、5、6和8)混合免疫兔和豚鼠,制备高免血清。以兔抗EHDV为捕获抗体,豚鼠抗EHDV为检测抗体,羊抗豚鼠IgG-HRP为酶标抗体,建立了EHDV抗原捕获ELISA(antigen capture ELISA,AC-ELISA)方法。通过反应条件优化,获得最佳工作条件:5%马血清为稀释液,包被抗体1∶15 000稀释,检测抗体1∶20 000稀释,酶标抗体1∶15 000稀释。通过检测60份阴性样品确定临界值,P/N值≥2为阳性、P/N值<1.5为阴性;特异性试验表明该方法仅能检测出各血清型EHDV、蓝舌病病毒(BTV)、赤羽病病毒(AKAV)及中山病毒(CHUV)无交叉反应;敏感性试验表明该方法可以检出102.47±0.07 TCID50的病毒;批内和批间变异系数均<10%;用RT-PCR与该方法同时对70份参考样品进行检测,符合率为92.86%。表明本试验建立的AC-ELISA方法为EHDV抗原检测提供了一种可靠实用的技术手段。

人巨细胞病毒UL32和UL44融合基因的表达及其抗原性分析

目的用聚合酶链式反应(PCR)扩增人巨细胞病毒UL32、UL44截短基因,构建pET-32a-UL32-UL44表达载体,转化宿菌大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,对目的蛋白进行纯化、标记HRP,用于检测IgM抗体。方法根据Gene-bank中HCMV的pp150、pp52蛋白序列,利用Protean计算机软件分析其亲疏水性和抗原性,选取适合的区段,根据其对应的UL32、UL44基因核苷酸序列设计合成引物,PCR扩增目的基因序列,经测序证明无误之后,克隆pET-32a-UL32-UL44重组质粒,将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,进行诱导表达,纯化目的蛋白,标记HRP,用ELISA捕获法对目的蛋白-HRP标记物的灵敏性和特异性等指标进行评价。结果成功构建pET-32a-UL32-UL44重组质粒,导入在BL21(DE3)菌株中,经诱导后目的蛋白表达于上清中,经纯化、标记HRP,标记物用于ELISA捕获法能够准确、特异地检测HCMV血清标本,80份血清检测结果显示其灵敏度可达92.5%,特异性达97.5%。结论 HCMV基因工程重组蛋白具有较好的免疫活性,为研制以基因工程重组抗原代替传统全病毒抗原的HCMV检测试剂盒打下了基础。