阿托伐他汀通过内质网应激调节乙醇作用下AC16心肌细胞超微结构及脂质合成代谢

目的探讨阿托伐他汀通过内质网应激(ERS)对乙醇作用下AC16心肌细胞超微结构及脂质合成代谢的影响及机制。方法建立乙醇作用下AC16心肌细胞ERS模型,并通过Western blotting检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的表达,确认ERS模型建立成功。使用不同浓度(1、10、100μmol/L)阿托伐他汀处理乙醇作用下AC16心肌细胞,采用Western blotting检测GRP78蛋白的表达,电镜观察心肌细胞超微结构,检测脂质合成代谢关键蛋白固醇调节原件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、甘油三酯含量变化。结果成功建立乙醇作用下AC16心肌细胞ERS模型。相对于乙醇组,1、10、100μmol/L阿托伐他汀组GRP78、SREBP-1c和甘油三酯含量均显著降低。乙醇组细胞形态异常、细胞内线粒体数量明显减少、线粒体增大、线粒体嵴结构紊乱,随着阿托伐他汀干预浓度增加,细胞形态及线粒体结构逐渐趋于正常,其中100μmol/L阿托伐他汀组可见大量线粒体,呈椭圆形,线粒体嵴结构整齐,同正常组。结论阿托伐他汀可抑制乙醇作用下ERS相关因子GRP78的表达,改善酒精性心肌病细胞模型细胞体态、线粒体等超微结构及脂代谢情况。

Carabin过表达对人心室肌细胞AC16氧糖剥夺后凋亡的影响

目的 探讨Carabin基因过表达对氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation,OGD）诱导的人心室肌细胞株AC16凋亡的作用。方法 构建Carabin过表达及空载稳定细胞株,将AC16细胞分为空载常氧组、Carabin过表达常氧组、空载OGD 24 h组和Carabin过表达OGD 24 h组。空载常氧组及Carabin过表达常氧组置于正常条件下培养;空载OGD 24 h组和Carabin过表达OGD 24 h组置于Hanks液中放入缺氧恒温细胞培养箱培养24 h（1%O2-5%CO2-94%N2）。采用倒置显微镜观察细胞形态变化;流式细胞术检测心肌细胞凋亡率及存活率; TUNEL染色检测细胞凋亡情况;通过酶标仪检测心肌细胞凋亡蛋白酶Caspase-3和心肌细胞损伤标志物LDH的活性; Western blot检测细胞凋亡蛋白Caspase-3的表达水平。结果 AC16细胞OGD 24 h后,细胞内Carabin的mRNA及蛋白水平显著降低。与空载常氧组比较,空载OGD 24 h组及Carabin过表达OGD 24 h组的细胞凋亡率、Caspase-3活性、LDH活性及Caspase-3蛋白表达水平均显著升高（P 〈0. 05）。与空载OGD 24 h组比较,Carabin过表达OGD 24 h组的细胞凋亡率、Caspase-3活性、LDH活性及Caspase-3蛋白表达水平显著降低（P 〈0. 05）。结论 Carabin过表达能显著减轻OGD诱导后AC16细胞的凋亡。

龙牙楤木总皂苷及楤木皂苷A对缺氧/复氧诱导的AC16心肌细胞铁死亡的影响

目的探讨龙牙楤木总皂苷及其组分楤木皂苷A能否减轻缺氧/复氧诱导的AC16心肌细胞铁死亡。方法将AC16细胞随机分为正常组、模型组、龙牙楤木总皂苷组、楤木皂苷A组。通过缺氧24小时、复氧12小时建立AC16细胞缺氧/复氧模型,药物组缺氧/复氧损伤前6小时给予药物处理。CCK-8检测细胞存活率,乳酸脱氢酶检测试剂盒检测细胞受损程度,透射电子显微镜观察AC16细胞形态学变化,比色法检测Fe^(2+)水平,酶联免疫试剂盒检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平,DHE荧光探针检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,蛋白免疫印迹法检测铁死亡相关蛋白p53、SLC7A11、SAT1、GLS2的表达。结果与正常组相比,模型组AC16细胞存活率明显下降,细胞受损程度明显升高,细胞内的线粒体皱缩、内嵴增厚、膜电子密度增高,Fe^(2+)、ROS、MDA水平明显上升,GSH活力明显下降,铁死亡相关蛋白p53、SAT1、GLS2蛋白表达明显升高,SLC7A11蛋白表达明显降低,以上结果差异均具有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,龙牙楤木总皂苷组及楤木皂苷A组AC16细胞存活率明显上升,细胞受损程度明显降低,细胞内的线粒体形态趋于正常状态,Fe^(2+)、ROS、MDA水平下降,GSH活力升高,铁死亡相关蛋白p53、SAT1、GLS2蛋白表达下调,SLC7A11蛋白表达上调,以上结果差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论龙牙楤木总皂苷及其组分楤木皂苷A能减轻缺氧/复氧诱导的AC16心肌细胞铁死亡,其机制可能与抑制p53、SAT1、GLS2蛋白表达,上调SLC7A11蛋白表达有关。

高迁移率族蛋白1通过调控自噬因子P62调节心肌细胞纤维化

目的:探究高迁移率族蛋白1(HMGB1)通过调控自噬活性对心肌纤维化的影响及作用机制。方法:将人心肌细胞AC16培养于DMEM培养基中,用不同浓度的HMGB1(0、4、20、100μg/L)干预AC16细胞6 h,免疫荧光染色检测心脏成纤维细胞活化的标志性蛋白α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平,Western blot法检测心肌自噬相关蛋白哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、磷酸肌醇-3-激酶3(PIK3C3)、可溶性及不可溶性P62、α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)在AC16中的表达水平。免疫共沉淀检测α-SMA与P62之间的互相作用。结果:不同浓度的HMGB1刺激AC16细胞,AC16细胞中心肌纤维化标志蛋白CollagenⅠ与α-SMA的表达水平呈浓度依赖性升高,自噬蛋白PIK3C3、不可溶性P62的蛋白表达水平,p-mTOR与mTOR的比值,LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值呈浓度依赖性升高,可溶性P62的蛋白表达水平呈浓度依赖性降低。各组间的差异均有统计学意义(P均<0.01)。免疫共沉淀实验显示P62与α-SMA存在相互作用。结论:外源性HMGB1可抑制AC16细胞中的自噬流,诱导AC16细胞纤维化。

基于NR3C1/p53/SLC7A11通路探讨龙牙楤木总皂苷及其成分楤木皂苷A对缺氧/复氧诱导的心肌细胞铁死亡的影响

目的基于NR3C1/p53/SLC7A11通路观察龙牙楤木总皂苷(As)及其成分楤木皂苷A(As A)对缺氧/复氧(H/R)诱导的AC16心肌细胞铁死亡的影响。方法通过缺氧24 h/复氧12 h建立AC16细胞H/R损伤模型,采用细胞转染法调控NR3C1表达,将细胞分为正常组、H/R组、As组(As+H/R)、As A组(As A+H/R)、过表达空载体组(过表达空载体+H/R)、NR3C1过表达组(NR3C1过表达+H/R)、沉默对照组(si-NC+As+H/R)和NR3C1沉默组(si-NR3C1+As+H/R),分别进行相应干预,荧光探针检测活性氧(ROS)水平,ELISA检测丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量,Western blot检测NR3C1、p53和SLC7A11蛋白表达,免疫荧光染色检测NR3C1和p53蛋白表达。结果与正常组比较,H/R组AC16细胞ROS和MDA水平明显升高,GSH水平明显降低(P<0.05),NR3C1和SLC7A11蛋白表达明显降低,p53蛋白表达明显升高(P<0.05);与H/R组比较,As组、As A组和NR3C1过表达组AC16细胞ROS和MDA水平明显降低,GSH水平明显升高(P<0.05),NR3C1和SLC7A11蛋白表达明显升高,p53蛋白表达明显降低(P<0.05);与过表达空载体组比较,As组和NR3C1过表达组AC16细胞ROS和MDA水平明显降低,GSH水平明显升高(P<0.05),NR3C1和SLC7A11蛋白表达明显升高,p53蛋白表达明显降低(P<0.05);与As组及沉默对照组比较,NR3C1沉默组AC16细胞ROS、MDA水平明显升高,GSH水平明显降低(P<0.05),NR3C1和SLC7A11蛋白表达明显降低,p53蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论As及As A可能通过上调NR3C1、SLC7A11蛋白表达,下调p53蛋白表达,抑制H/R诱导的AC16心肌细胞铁死亡。

SIRT1/p66Shc介导小檗碱对阿霉素诱导心肌毒性拮抗作用研究

【目的】基于细胞水平观察小檗碱对阿霉素诱导心肌细胞沉默信息调节因子2同源蛋白1(SIRT1)/p66Shc通路的影响,探讨小檗碱抗阿霉素所致心肌毒性作用的机制。【方法】应用阿霉素(1μmol/L)处理人心肌细胞系AC16建立阿霉素心肌毒性模型。四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定细胞存活率,二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)染色荧光显微镜照像测定细胞活性氧簇(ROS)水平,罗丹明123(Rh123)染色荧光显微镜照像测定线粒体膜电位(MMP),荧光染料Rhod2-AM(分子探针)测定线粒体Ca^(2+)浓度([Ca^(2+)]m),蛋白免疫印迹(Western Blot)法测定细胞SIRT1、p66Shc及凋亡蛋白Bax的表达水平。【结果】用1μmol/L小檗碱预处理可明显抑制1μmol/L阿霉素引起的AC16心肌细胞毒性作用,使细胞存活率升高,表现为抑制阿霉素引起的细胞内ROS生成增多、抑制阿霉素致细胞凋亡(使凋亡蛋白Bax表达下调)和减轻线粒体损伤。阿霉素处理的AC16心肌细胞中p66Shc表达增强且SIRT1蛋白表达下降;预先加用小檗碱组中,阿霉素上调p66Shc及下调SIRT1表达的效应显著减弱;而1μmol/L EX527(SIRT1抑制剂)预处理则加重阿霉素引起的AC16细胞损伤,这种细胞损伤未能被小檗碱预处理所改善。【结论】小檗碱可通过SIRT1介导的p66Shc抑制保护AC16心肌细胞对抗阿霉素诱导的心肌毒性。

心肌细胞株的特性及其在心血管疾病研究中的应用

心肌细胞株是研究心血管疾病发病机制和药物筛选的重要材料,不同的心肌细胞株其生物学特性存在较大差异。在心血管疾病研究中,心肌细胞株的选择与研究结果密切相关。现围绕当前心肌细胞株的生物学特性及其在研究中的应用展开综述,并提出了研究展望,以进一步拓展对于心肌细胞株的认识,为心血管疾病研究提供参考。

人Carabin基因过表达的9型重组腺相关病毒的构建及功能鉴定

目的:构建人Carabin基因过表达的9型重组腺相关病毒,并对其进行结构和功能鉴定。方法:对目的基因质粒pUC57-carabin和载体质粒pAAV9-IRES-ZsGreen进行EcoRI+XhoI双酶切,在T4DNA Ligase作用下连接酶切产物,在JM109感受态细胞中筛选pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen质粒,将pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen质粒应用高效HET kit转染试剂盒转染至293AAV细胞,以包装rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen腺相关病毒,利用Q-PCR检测病毒滴度。rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen感染人心室肌细胞株AC16,western blot检测carabin蛋白表达。结果:pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen过表达质粒构建成功,rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen腺相关病毒包装顺利,滴度为5.09E+12 vg/mL,感染AC16后,carabin蛋白表达显著上调。结论:rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen腺相关病毒构建成功,并在心肌细胞中具有高效表达carabin的效应。

miR-1306-5p靶向水通道蛋白1对糖尿病心肌病变的调控作用

目的:探究miR-1306-5p对糖尿病心肌病变的影响和可能机制。方法:体外培养人心肌细胞AC16,分为对照组和高糖组,作用24 h后,收集细胞上清液,采用全自动生化分析仪检测心肌酶CK、LDH和AST水平,采用Western blot检测AC16细胞中心肌病变相关蛋白ANF、β-MHC、TGF-β的表达以及水通道蛋白1(AQP1)的表达,采用qRT-PCR检测miR-1306-5p和AQP1 mRNA的表达。采用双荧光素酶实验验证miR-1306-5p与AQP1的靶向关系。另取AC16细胞,观察抑制miR-1306-5p的表达或同时抑制miR-1306-5p和AQP1的表达对心肌酶的分泌、心肌病变相关蛋白表达、凋亡率以及凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达的影响。结果:高糖处理提高了AC16细胞心肌酶CK、LDH和AST的分泌,心肌病变相关蛋白ANF、β-MHC、TGF-β以及miR-1306-5p的表达,降低了AQP1的表达(P<0.05)。miR-1306-5p与AQP1存在负向靶控关系。抑制miR-1306-5p表达降低了高糖诱导的AC16细胞凋亡率、心肌酶的分泌及心肌病变相关蛋白和Bax蛋白的表达水平,提高了Bcl-2蛋白的表达水平(P<0.05);抑制AQP1逆转了抑制miR-1306-5p对高糖诱导的AC16细胞上述指标的改善作用(P<0.05)。结论:抑制miR-1306-5p表达可能通过靶向上调AQP1减轻高糖诱导的心肌细胞损伤。

大质粒转染人源心室肌Ac16细胞条件探究

该研究主要针对大质粒转染人源心室肌Ac16细胞的方式及最适条件进行摸索。采用人源心室肌Ac16细胞作为研究模型,分别用Lip3000转染、核酸脂质体(Hieff Trans;Liposomal)转染和慢病毒转染三种方法将外源大质粒pLenti-CasRx-EGFP导入Ac16细胞中,通过统计表达绿色荧光蛋白的阳性细胞比例,分析外源基因的转染效率,探索大质粒pLenti-CasRx-EGFP的最佳转染方式和转染条件。结果表明,Lip3000转染Ac16细胞的最适转染条件为:质粒与Lip3000的比例为1:2;核酸脂质体转染Ac16细胞的最适条件为:质粒与脂质体的比例为1:3;慢病毒感染Ac16细胞的最适MOI值为200;通过比较三种转染方式的转染效率发现慢病毒的转染效率最高。最后得出大于10 Kb的大型质粒(pLenti-CasRx-EGFP)转染人源心室肌Ac16细胞最适合的方式是利用慢病毒转染,最佳MOI值为200。