水稻PP2Ac类磷酸酶蛋白质在盐胁迫下的表达

【目的】了解重要蛋白质的表达模式进而探讨水稻耐盐的分子机理。【方法】采用基于抗体的蛋白质组学策略,用免疫印迹(western blotting)调查了5个PP2Ac类磷酸酶蛋白质在苗期盐胁迫条件下的表达。【结果】发现在耐盐水稻品种兰胜中,OsPP2Ac-4的表达上调,在盐敏感的水稻品种9311中,OsPP2Ac-2、OsPP2Ac-3和OsPP2Ac-5的表达也发生了上调,但OsPP2Ac-4的表达下调。比较2个品种间PP2Ac蛋白质的表达,发现在正常生长条件下,PP2Ac蛋白质的表达没有显著区别且基本保持恒定,其表达变化仅发生在盐胁迫条件下。分析水稻MPSS数据库提供的苗期盐胁迫的转录数据,发现OsPP2Ac-2、OsPP2Ac-3和OsPP2Ac-5在盐胁迫条件下转录水平下调。【结论】发现了4个盐胁迫条件下表达发生变化的PP2Ac蛋白质。

蛋白磷酸酶-2Ac在不同倍性鱼6种组织中的分化表达模式

蛋白磷酸酶-2A是最重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶之一,对于调控多细胞的生命活动起着非常重要的作用。以异源四倍体鲫鲤及其二倍体父/母本(湘江野鲤/红鲫)和子代三倍体湘云鲫等为实验材料,运用Westernblot技术及荧光免疫组织化学技术等实验手段,得到了Protein Phosphatase-2A(PP2A)的催化亚基在上述不同倍性鱼体内6种不同组织的表达模式:Protein Phosphatase-2Ac(PP2Ac)在异源四倍体鲫鲤及其二倍体父/母本及子代三倍体湘云鲫不同组织中蛋白水平均有表达,而且出现了明显的种属特异性和组织特异性,如在大脑、肌肉、肝脏三组织中,三倍体湘云鲫中PP2Ac的表达相对最高。而在肾脏组织中,PP2Ac在异源四倍体鲫鲤中的表达水平最高,父本与三倍体湘云鲫中的表达比较相近,且最低;而在性腺组织中则是父本精巢中的表达最高;在心脏组织中,PP2Ac在母本红鲫中的表达相对较高。这种明显的种属之间组织特异性可能说明了子代与父母本之间的变异性。荧光免疫组化实验结果显示,从整体水平来看,4种不同鱼的同一组织中,PP2Ac的相对定位是非常相似的,这可能说明了异源四倍体鲫鲤与其二倍体父/母本及子代三倍体湘云鲫之间的遗传相似性。研究结果为进一步探索PP2Ac在脊椎动物不同组织中的功能提供了实验依据。

蛋白磷酸酶2Ac介导Smad3中间连接区去磷酸化促肾小管上皮细胞间充质转分化的研究

目的:通过蛋白磷酸酶2Ac(PP2Ac)过表达和小干扰RNA质粒转染人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)后予以转化生长因子β1(TGF-β1)刺激,观察PP2Ac对细胞外基质合成、肾小管上皮细胞间充质转分化(EMT)和Smad3中间连接区磷酸化的影响,探讨PP2Ac促肾间质纤维化的机制。方法:常规培养HK-2细胞,分为对照组、TGF-β1组和质粒转染+TGF-β1组。采用RT-PCR和Western Blot法检测PP2Ac、纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E选择素(E-cadherin)表达水平。采用Western blot法检测Smad3、Smad3中间连接区p Smad3-L(p Ser204)和p Smad3-L(p Ser208)表达情况。结果:RT-PCR和Western Blot结果均显示:PP2Ac过表达质粒转染HK-2细胞再予TGF-β1刺激24h后,PP2Ac表达较TGF-β1组升高,同时FN、Col-Ⅰ和a-SMA表达明显上调,E-cadherin表达下调;而PP2Ac小干扰RNA转染HK-2细胞后再予TGF-β1刺激24h,较TGF-β1组,PP2Ac表达降低,FN、Col-Ⅰ和α-SMA表达减少,E-cadherin表达增高(P<0.05)。Western Blot结果显示:TGF-β1刺激HK-2细胞1h时PP2Ac和Smad3中间区磷酸化的蛋白表达均达到峰值;HK-2细胞转染PP2Ac过表达质粒再予TGF-β1刺激1h后,与单纯TGF-β1刺激组比较,核蛋白中p Smad3-L(p Ser204)和p Smad3-L(p Ser208)表达均下降;而PP2Ac小干扰RNA转染HK-2细胞再予TGF-β1刺激1h后,核蛋白中p Smad3-L(p Ser204)和p Smad3-L(p Ser208)蛋白表达均增加(P<0.05)。结论:PP2Ac促进肾小管上皮细胞外基质的生成及EMT;PP2Ac介导肾小管上皮细胞Smad3中间连接区去磷酸化。

中国番茄黄化曲叶病毒和烟草曲茎病毒AC2和AC4蛋白为RNA沉默的抑制子

中国番茄黄化曲叶病毒Y10分离物(TYLCCNV-Y10)能系统侵染本氏烟(Nicotiana benthamiana) 等寄主植物,但不诱导明显的症状,而烟草曲茎病毒Y35分离物(TbCSV-Y35)单独侵染则诱导曲叶等症状.对表达GFP基因的转基因本氏烟接种实验表明,TYLCCNV-Y10不回复已建立的GFP沉默,也不抑制GFP沉默的建立;而TbCSV-Y35能部分回复已建立的沉默,且能在新叶抑制沉默的建立.农杆菌共浸润实验结果表明,TYLCCNV-Y10和TbCSV-Y35的AC2和AC4蛋白都能抑制GFP的局部沉默,并延迟GFP的系统沉默,为RNA沉默的抑制子.比较共浸润区GFP mRNA的积累结果表明,Y10 AC2与Y 35AC2蛋白具有相近的RNA沉默抑制能力,而Y35 AC4蛋白是一个比Y10 AC4蛋白更强的抑制子.因而,TbCSV-Y35和TYLCCNV-Y10致病性差异的原因可能与二者AC4蛋白的功能差异有关.

条件性敲除胰岛β细胞蛋白磷酸酶2Acα对小鼠糖代谢影响机制的探讨

目的探讨条件性敲除胰岛β细胞蛋白磷酸酶2Acα(PP2Acα)对小鼠血糖水平影响的机制。方法选取4月龄条件性敲除胰岛β细胞PP2Acα(KO组)及对照组(Con,与KO组同窝别、性别匹配)各24只。行腹腔葡萄糖耐量实验(IPGTT),测定0、30、60和120min小鼠血糖及胰岛素分泌水平;新鲜分离胰岛,用葡萄糖刺激胰岛素分泌实验(GSIS)评价小鼠胰岛β细胞对葡萄糖反应性。结果IPGTT结果显示,KO组葡萄糖负荷后30min血糖[(23.1±5.1)vs(17.5±5.7)mmol/L]和60min血糖[(20.5±6.8)vs(13.5±5.1)mmol/L]高于Con组(P<0.05);KO组葡萄糖负荷后30min血清胰岛素水平较Con组下降[(2.16±0.92)vs(1.07±0.42)μg/L](P<0.05);GSIS显示高糖刺激下KO组胰岛素分泌较Con组减少[(0.82±0.15)vs(0.42±0.24)μIU/L](P<0.05)。结论条件性失活胰岛β细胞PP2Acα小鼠糖耐量受损可能与胰岛素一相分泌受损相关。

Cry1Ac和Cry2Ab蛋白对大草蛉生长发育及酶活力的影响

为明确转Cry1Ac和Cry2Ab基因棉花对大草蛉的影响,运用Bt蛋白与人工饲料混合的方法,以大于转基因棉花叶片中蛋白含量20倍的剂量饲喂大草蛉初孵幼虫,初步研究了Cry1Ac和Cry2Ab对大草蛉生物学参数和消化酶、解毒酶活性的影响。结果表明:取食含Bt蛋白饲料的大草蛉幼虫的发育历期、体重、蛹重、成虫体重、羽化率等生物学参数与对照相比均没有显著差异;在大草蛉幼虫体内可以检测到含量较高的Cry1Ac和Cry2Ab蛋白,分别为974.92~1282.39 ng/g鲜重和5592.62~6082.92 ng/g鲜重,而在大草蛉成虫体内检测到的Cry1Ac和Cry2Ab蛋白含量非常低,分别为0.29~0.39 ng/g鲜重和50.34~56.71 ng/g鲜重;取食含Bt蛋白的饲料对大草蛉幼虫的类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、氨肽酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性有一定的影响,但对大草蛉成虫影响与对照差异不显著。表明大草蛉取食含Bt蛋白的人工饲料后,虽然体内可以检测到一定含量的Bt蛋白,但对大草蛉的生长发育并没有显著的直接不利影响。

膜联蛋白A1拟肽Ac2-26减轻大鼠体外循环肺损伤的抗炎机制

目的探讨膜联蛋白A1(AnxAl)拟肽Ac2-26对体外循环(CPB)大鼠肺损伤的影响,分析其抗炎机制。方法18只雄性SD大鼠,体质量350~450 g。随机数字表法分为3组(各6例):假手术组(S组)、缺血再灌注组(IR组)、Ac2-26组(A组)。假手术组行股动静脉穿刺置管,仅开胸暴露左肺,不连接CPB管道;其余2组均建立CPB左肺缺血再灌注损伤模型,IR组在CPB前10 min给予同等容量的生理盐水;A组在CPB前10 min尾静脉注射Ac2-26(1 mg/kg)。3组大鼠于CPB前(T1)、开放左肺门即刻(T2)、实验结束时(T3)分别取动脉血,行血气分析,计算氧合指数(OI)和呼吸指数(RI)。于T1、T3分别取股静脉血测中性粒细胞(PMN)的数量。T3时取肺动脉血测PMN的数量、大鼠血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)含量;取左肺组织,ELISA法测肺组织中髓过氧化物酶(MPO)和PMN弹性蛋白酶(NE)含量,Tunel法测肺组织中性粒细胞凋亡;Western-Blot测肺组织细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和AnxAl蛋白表达情况。结果与S组比较,IR组T3时点的股静脉血、肺动脉血PMN数量及肺动脉VCAM-1含量高,肺组织MPO、NE含量增加,肺组织病理损伤评分升高、OI降低、RI升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与IR组比较,A组大鼠肺组织病理损伤评分明显降低,股静脉血、肺动脉血PMN数量及肺动脉血VCAM-1含量明显减少,肺组织AnxA1、ICAM-1表达降低,肺组织MPO、NE含量降低,PMN凋亡率升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论膜联蛋白A1拟肽Ac2-26可抑制肺内中性粒细胞聚集,减弱中性粒细胞与肺血管内皮的黏附能力,促进肺内中性粒细胞凋亡,降低NE、MPO含量,对大鼠CPB后肺损伤有保护作用。

HBsAg抑制聚乙二醇化α干扰素治疗敏感性的初步分子机制

目的:对HBsAg引起干扰素治疗无效的机制进行初步探讨,为乙肝患者的治疗提供新思路。方法:分别以HBIG和RNAi技术调节HepG2.2.155细胞内HBsAg含量,再用Western blot、qRT-PCR和ELISA等方法检测PP2Ac、PRMT1蛋白及mRNA水平;分析干扰素对HBsAg诱导的PP2Ac表达有无影响。结果:用HBIG可以增加细胞内HBsAg含量,当HBsAg增加时PP2Ac的水平也会提高;当存在干扰素时,并不会影响HBsAg对PP2Ac的作用,而且PP2Ac的下游蛋白PRMT1表达会降低;用RNAi技术下调HBsAg的表达时,PP2Ac的蛋白和mRNA的水平也会下降。结论:HBsAg可以上调PP2Ac的表达,从而抑制了PRMT1的活性,影响干扰素治疗的敏感性。HBsAg可以影响Peg-IFNα的敏感性,可能是提高慢性乙型肝炎患者疗效的一个潜在靶标。