木薯花叶病毒AC4蛋白与AtPARN互作研究

木薯(Manihot esculenta Crantz)作为重要的热带作物,是全球六大粮食作物之一,并为全球近七亿人口提供主粮,然而病毒侵染引起的病害在全球范围内严重威胁木薯产业的发展。木薯花叶病毒病(cassava mosaic disease,CMD)是最有威胁的病害之一,造成严重的经济损失。斯里兰卡木薯花叶病毒(SriLankancassavamosaicvirus,SLCMV)是引发木薯花叶病的病原物之一,SLCMV是典型的双组分双生病毒,其基因组由DNA-A和DNA-B两个环状组分组成。无义介导的mRNA降解(nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD)是真核细胞mRNA降解的主要途径之一,也是真核生物普遍存在的抗病毒防御机制。越来越多的研究显示,NMD不仅是真核生物重要的mRNA数量、质量调控机制,还与转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS)同样能降解病毒RNA,是真核生物普遍存在的抗病毒防御机制。NMD的mRNA衰减过程包括PTC的识别、脱腺苷酸、脱帽和最后的核酸外切酶降解4个过程,UPF1、PARN、DCP2和XRN4分别是上述4个过程中的关键蛋白。病毒是专性寄生生物,必须逃避或耐受寄主细胞的降解,才能成功感染。聚腺苷酸特异性核糖核酸酶[poly(A)-specific ribonuclease,PARN]是NMD信号通路的一个关键因子。目前,关于SLCMV抵御寄主NMD的分子机制尚不明确。本研究采用酵母双杂交(yeast two-hybrid system)和荧光双分子互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)试验证明斯里兰卡木薯花叶病毒(SLCMV)编码的沉默抑制子AC4与拟南芥PARN相互作用。据此推测SLCMV AC4蛋白可能通过与AtPARN相互作用而抑制寄主NMD的病毒防御功能帮助病毒逃避或耐受寄主细胞的降解。研究结果为阐明木薯花叶病毒调控寄主NMD抗病毒防御功能的分子机理奠定基础。

中国番茄黄化曲叶病毒编码的RNA沉默抑制子AC4蛋白的核酸结合特性

农杆菌共浸润试验结果表明:中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)Y10分离物编码AC4蛋白是RNA沉默抑制子。为了研究RNA沉默抑制子AC4蛋白的作用机制,将TYLCCNV-Y10的AC4基因插入到原核表达载体pET-32a的多克隆位点上,构建重组原核表达载体pET32a-Y10AC4。将重组载体导入BL21(DE3)pLysS进行AC4蛋白表达,并在自然条件下纯化蛋白。利用原核表达的AC4蛋白进行电泳迁移率变动试验(electrophoretic mobilityshift assay,EMSA),分析AC4蛋白分别与单、双链siRNA和单、双链长RNA的结合情况。试验结果表明:TYLCCNV-Y10编码的AC4蛋白具有结合单链siRNA和单链长RNA特性,而不与双链siRNA和双链长RNA结合。