外源ACC对龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)果孢子放散的生理影响及转录组分析

龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)是我国产量第二大的养殖海藻,以龙须菜为材料,分别添加5种浓度的1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC),探究了其对龙须菜果孢子放散的作用,结果发现250μmol/L的ACC促进果孢子放散效果最佳。外源添加250μmol/L的ACC后,第2天和第5天龙须菜光合作用进一步下降,第5天后超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽还原酶(GR)活性以及还原型抗坏血酸(AsA)含量显著上升,表明龙须菜果孢子的放散还和抗氧化系统密切相关。转录组结果显示ACC处理后第5天光合作用相关基因表达量下调,糖酵解通量增加,TCA循环和氮代谢途径的基因表达量显著上调;外源ACC显著上调了茉莉酸合成途径相关基因的表达,但对乙烯合成途径相关基因无显著影响。研究结果验证了ACC促进龙须菜果孢子放散的作用,为龙须菜的快速繁育提供了新的技术支撑。

番茄ACC合成酶cDNA克隆及其对果实成熟的反义抑制

利用ＲＴＰＣＲ技术克隆了ＡＣＣ合成酶多基因家族成员之一ＬＥＡＣＣ２编码区约１７ｋｂ的ｃＤＮＡ，经酶切图谱和序列分析鉴定无误后，反向插入到植物表达载体ｐＢｉｎ４３７中，构建了表达ＡＣＣ合成酶反义ＲＮＡ的二元载体。经农杆菌途径转化番茄“丽春”品种后，通过ＰＣＲ检测从抗卡那霉素再生植株中筛选到６株转基因植株，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交确证了外源基因是以单拷贝插入到番茄染色体中；对果实乙烯释放的测定结果表明转基因番茄果实的乙烯释放量仅为对照的３０％左右，在室温下转基因番茄果实采后保存６０ｄ以上仍然没有变红、软化。以上结果表明其反义ＲＮＡ在转基因番茄中的表达能有效地抑制乙烯的生物合成从而延缓果实成熟，表现出良好的耐储保鲜特性。对转基因植株子一代（Ｔ１）的分析结果进一步表明反义ＡＣＣ合成酶基因以典型的单基因方式传到子代。通过对子二代的分析已初步筛选到一个耐储藏的转基因番茄纯合品系。

甘蔗ACC氧化酶基因片段的克隆与序列分析

1 -氨基环丙烷 - 1-羧酸 (ACC)氧化酶是植物乙烯合成的一个关键酶 ,乙烯作为一种内源激素 ,对植物生长、老熟过程有多方面的调节作用。根据报道的各种植物ACC氧化酶氨基酸序列上前后两个保守区设计两个简并引物 ,以甘蔗总DNA为模板 ,通过PCR扩增到一个 940bp的基因片段。将片段序列在NCBI的BLAST软件上进行同源性搜寻 ,显示的 63个序列全部是ACC氧化酶基因 ,因而认为克隆到的片段就是甘蔗ACC氧化酶基因的一个成员。经对不同植物来源的ACC氧化酶基因家族进行比较分析 ,去除一个 10 3bp的“内含子”后 ,推导的氨基酸序列为 2 79个残基 ,占推测全长氨基酸残基总数的 86%左右。经同源性分析 ,序列与毛竹和水稻ACC氧化酶的同源率达到 86%。系统进化分析表明 ,该序列最先与水稻、其次和香蕉的ACC氧化酶聚类 ,然后再与双子叶植物的ACC氧化酶聚类 ,符合按形态特征分类的血缘关系。基因的获得对下一步了解乙烯的合成表达与甘蔗生长。

猕猴桃ACC氧化酶cDNA克隆及全序列测定

从‘秦美’猕猴桃（ＡｃｔｉｎｉｄｉａｄｅｌｉｃｉｏｓａＣ．Ｆ．ＬｉａｎｇｅｔＡ．Ｒ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ．ｃｖ．Ｑｉｎｍｅｉ）呼吸高峰跃变初期的果实中提取总ＲＮＡ，然后纯化得ｍＲＮＡ，用Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）作为引物反转录合成ｃＤＮＡ第一链，以此为模板，用人工合成的寡聚核苷酸作为引物进行扩增，得到大小约０．９５Ｋｂ基因片段，并将其克隆到ｐＧＥＭ－５ｚｆ（＋）载体上。经限制性内切酶图谱分析，组建亚克隆并进行了全序列测定，在其开放读码框架内，由９５７个ｂｐ编码３１９个氨基酸组成，该ｃＤＮＡ与海沃德ＡＣＣ氧化酶ｃＤＮＡ的核苷酸和氨基酸残基同源率分别达９５．０１％和９５．６１％，证明己克隆到完整的秦美猕猴桃ＡＣＣ氧化酶基因编码区。

水稻籽粒中乙烯和ACC对土壤水分的反应及其与籽粒灌浆的关系

以武运粳8号(粳稻)和扬稻6号(籼稻)为材料,自抽穗后9d至成熟期进行保持浅水层(WW)、土壤轻度落干(MD)和土壤水分严重亏缺(SD)3种处理。观察在不同土壤水分条件下灌浆期籽粒中乙烯和1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)浓度的变化及其与籽粒灌浆的关系,并使用化学调控物质进行验证。结果表明,MD显著提高籽粒灌浆速率和粒重,SD明显降低籽粒灌浆速率和粒重。籽粒中乙烯释放速率和ACC浓度在MD中降低,在SD中增加。籽粒乙烯释放速率及根系伤流液中ACC浓度与籽粒中ACC浓度呈极显著的正相关。籽粒灌浆速率与乙烯释放速率呈极显著负相关。在花后9～13d喷施乙烯合成的抑制物质氨基-乙氧基乙烯基甘氨酸(AVG),明显降低籽粒中ACC的浓度和乙烯的释放速率,显著提高了籽粒灌浆速率和粒重以及籽粒中的蔗糖合成酶(SuSase)、ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)和可溶性淀粉合成酶(SSSase)活性;喷施乙烯释放的促进物质乙烯利,结果则相反。表明结实期土壤轻度落干或适度干旱处理可以抑制水稻体内乙烯的产生,促进籽粒灌浆。

不同性别类型黄瓜ACC合酶基因的单核苷酸多态性标记和酶切扩增长度多态性标记

黄瓜的性别分化与乙烯密切相关,1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合酶是乙烯生物合成过程中的关键酶.根据ACC合酶基因家族的保守序列设计PCR引物,从8个不同性别类型(雌雄同株、强雌性和全雌性)黄瓜品种中克隆了长度为1188bp的ACC合酶基因(CS-ACS2)片段(GenBank登记号为:DQ115884～DQ115886和DQ115875～DQ115879).经测序分析,3个雌雄同株性别类型品种的序列完全相同.与之相比,5个强雌性和全雌性品种中存在8个单核苷酸多态性(SNPs)标记,SNPs标记为4个A←→G和4个T←→C之间的转换.在8个SNPs中,有1个SNP位于内含子区域,其余7个SNPs都位于外显子区域.在7个位于外显子区域的SNPs中,有3个为非编码区的SNPs,4个为cSNPs.而在4个cSNPs中,有3个导致了编码的氨基酸序列改变.研究结果表明,与雌雄同株性别类型相比,雌性系中均存在单核苷酸的变异,这提示ACC合酶基因CS-ACS2的单核苷酸变异可能与黄瓜雌性系的发生形成有关.另一方面,根据SNP多态性还发展了一个酶切扩增长度多态性(CAPS)标记C-MT700.利用CAPS标记C-MT700能将强雌性优良品种MT-705与其他黄瓜品种相区别,该标记在黄瓜育种生产上具有一定的应用价值.此外,研究获得的SNPs标记和CAPS标记丰富了黄瓜的分子标记种类.

番茄ACC合成酶基因的反义RNA-核酶嵌合基因植物表达载体的构建及对番茄的转化

将克隆的番茄 ACC合成酶基因的反义 RNA-核酶嵌合的 DNA序列用 Hind 和 Kpn I切割后重组于植物表达载体 p GA643中 ,用三亲融合法导入农杆菌 LBA4 40 4中 ,采用叶盘法转化番茄子叶 ,诱导出再生小植株 ,获得了卡那霉素的抗性植株 .提取植物总 DNA,用p GA643作探针 ,通过斑点杂交 ,已筛选出整合有外源基因的工程植株 .为进一步研究该嵌合基因对 ACC合成酶基因表达的影响及获得商品化的转基因番茄奠定了基础 .

乙烯抑制剂AVG和促进剂ACC对大豆幼苗叶片光合特征的影响

采用不同浓度乙烯抑制剂氨基乙氧基乙烯甘氨酸(aminoethoxyvinylglycine,AVG)和促进剂1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocylopropane-1-carboxylic acid,ACC)对盆栽大豆幼苗进行处理,探讨其对光响应曲线、CO2响应曲线等光合特性的影响.结果表明:与对照相比,AVG处理明显提高了大豆幼苗叶片净光合速率、蒸腾速率和气孔导度,降低了胞间CO2浓度;明显提高了光饱和点、光饱和光合速率、表观量子效率、CO2饱和点、羧化效率、RuBP最大再生速率,同时,降低了光补偿点和CO2补偿点;此外,AVG处理还提高了大豆幼苗生物量和叶面积,降低了叶片乙烯释放量、叶绿素含量与气孔密度;ACC处理的效果与AVG相反.以上结果表明,外源AVG处理能改善大豆幼苗叶片的光合性能.

授粉诱导蝴蝶兰雌蕊中乙烯合成和ACC氧化酶基因表达

对蝴蝶兰（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ “Ｇｅｎｅｒａｌｋｕ”ｈｏｒ．）在授粉后乙烯的合成和１－氨基环丙烷－１－羧酸（ＡＣＣ）氧化酶基因的表达进行了研究。实验结果显示在授粉后１２、２４ 和４８ ｈ，柱头和花柱中乙烯的产生和ＡＣＣ氧化酶ｍ ＲＮＡ 的积累显著下降，而子房中则明显上升，表明授粉后雌蕊中乙烯的产生与ＡＣＣ氧化酶基因的表达密切相关。此外，授粉后雌蕊的柱头中合成的乙烯相对量最多，花柱次之。

番茄ACC合成酶反义cDNA转化及转基因番茄果实贮藏生理特性研究

ACC 合成酶 cDNA 被反向插入载体 PMON316,通过三亲交配,将表达质粒转移到农杆菌中,采用叶盘法转化番茄子叶。经卡那霉素筛选及分子杂交检测,表明,反义 ACC 合成酶基因已在 mRNA 水平表达。对转基因番茄果实的成熟生理指标测定结果说明,转基因番茄果实成熟受到严重抑制,乙烯的峰值仅为正常番茄的25%～30%,PG 活性有所下降,果实在室温下可贮藏1个多月,品质和其他性状与正常番茄相近。

环境胁迫和激素诱导甘蔗ACC合成酶基因家族三个成员的表达

ACC合成酶(ACS)是高等植物乙烯生物合成途径中的限速酶。在克隆到甘蔗ACC合成酶基因家族3个成员Sc-ACS1、Sc-ACS2和Sc-ACS3的基础上,分别以它们作为探针,检测了激素诱导和环境胁迫对甘蔗苗期该3成员表达的影响。结果表明,乙烯利诱导Sc-ACS1在叶中表达,在根中不表达;Sc-ACS2在根、叶中表达;Sc-ACS3主要在根部表达,在叶中不表达。在甘蔗叶片中,Sc-ACS1对冷胁迫、暗培养和LiCl胁迫均有应答,并受植物生长激素IAA诱导而表达;Sc-ACS2无论是在生长激素诱导还是环境胁迫下,其mRNA均维持较低水平。

温度对采后梨果实多胺、ACC含量、EFE活性和乙烯生成量的影响

测定了两个日本梨品种菊水和二十世纪(Pyrus serotina Rehder var.culta.Rehder)在30、15和5℃贮藏温度下,多胺、ACC含量、EFE活性和乙烯释放速率的变化。1.15和5℃低温可显著抑制梨果实内EFE活性,乙烯生成速率显著降低;2.两品种对低温的敏感性存在差异,15℃低温处理既能减少二十世纪梨的乙烯生成速率,也能抑制乙烯释放高峰的出现,而同样的温度处理仅能减少菊水梨的乙烯生成速率,不能抑制乙烯释放高峰的出现;3.在15和5℃处理下,两品种果实内ACC含量和丁二胺含量均呈上升趋势,5℃处理比15℃处理明显;4.梨果实内含有3种多胺,其中以丁二胺和亚精胺为主,丁二胺与梨果实内乙烯生物合成的抑制作用有密切关系;5.品种间在EFE活性、ACC含量和多胺含量上的差异决定了它们在乙烯生成速率上的差异。

甘蔗ACC氧化酶全长cDNA的克隆及序列分析

ACC氧化酶是高等植物乙烯生物合成途径中的限速酶。根据报道的植物ACC氧化酶基因序列设计特异引物，从甘蔗cDNA文库中克隆到-ACC氧化酶基因片段，命名为GZ-AC0，该基因长792bp，与甘蔗基因组文库中克隆的ACO基因片段仅18个碱基之差。根据该cDNA片段序列，设计两对末端扩增的特异引物，利用RACE-PCR技术，获得GZ-ACO片段的5’端和3’端序列。用VectorNTI7．0软件对三个序列进行拼接和分析，结果得到全长的甘蔗GZ-ACO氧化酶基因。GZ-ACO cDNA核苷酸序列长1307bp，具有一个972bp完整的读码框，启动子ATG位于126bp，终止子TAA位于1097bp，推导编码323个氨基酸。系统进化分析表明，GZ-ACO基因氨基酸序列与其它植物已报道的ACC氧化酶基因具有65％～86％的同源率，且与单子叶禾本科植物首先聚类，其次与单子叶芭蕉科、兰科植物聚类，最后与双子叶植物聚类，与植物形态的系统进化结果一致。该基因已在DDBJ／EMBL／GenBank基因数据库注册，注册号为AY521566。

乙烯利诱导甘蔗ACC合成酶基因家族三成员在茎中表达与乙烯释放量和糖分积累的关系

ACC合酶(ACS)是高等植物乙烯生物合成途径中的限速酶。为明确ACS基因在甘蔗茎中的表达与乙烯释放量、蔗糖积累的关系,在克隆到甘蔗ACS基因3个成员(Sc-ACS1、Sc-ACS2和Sc-ACS3)的基础上,分别以它们作为探针,Northern杂交检验其在茎中的时空表达。结果表明,甘蔗生长后期,ACS基因3个成员在茎中不同品种和节间持续表达,Sc-ACS1和Sc-ACS2表达维持较低水平,Sc-ACS3维持较高水平。乙烯利处理明显提高3个基因在茎的未成熟和正在成熟节间的表达,且Sc-ACS1和Sc-ACS2在未成熟节间的表达持续时间长达一个月,而Sc-ACS3在未成熟节间的较高水平表达可持续45d。该结果与甘蔗节间尤其是未成熟和正在成熟节间的乙烯释放量增加以及糖分积累的效应基本一致。相关分析表明,桂糖17品种乙烯释放量与蔗糖分在处理后14d和28d分别极显著和显著负相关,但巴西固氮品种B1未达显著水平。

芒果蒂腐病菌对芒果采后乙烯释放和ACC含量的影响

测定芒果蒂腐病菌(Botryodiplodia theobromae)对芒果果实乙烯代谢的影响,结果表明:B.theobromae在芒果果肉培养基上不产生乙烯,但是B.theobromae代谢活动能诱导芒果果肉中产生大量的1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC),导致芒果快速释放乙烯,随着发病程度增加和贮藏期延长,乙烯释放速率快速增加。高浓度乙烯使芒果果肉快速软化,在25℃条件下,果实在发病后3～5 d就完全腐烂。

Ca^(2+)对叶绿体中超氧物自由基产生以及由ACC形成乙烯的影响

高浓度Ca^(2+)(0.1 mol/L)使叶绿体产生O_2^+的能力下降,旋转相关时间(τ_c)增大34.3％,即膜的流动性降低,并抑制ACC形成乙烯;衰老时细胞内的Ca^(2+)作用却与此相反;O_2^+的生成与乙烯的产量成正相关(r=0.941)。EGTA,吩噻嗪和W_7等加入到叶绿体反应体系中,可使O_2^+的产量下降,ACC形成乙烯减少;相反,亚油酸作为Ca^(2+)载体,却使之明显升高,但亚油酸本身产生乙烯的量比ACC少得多。因此推测:高浓度Ca^(2+)可能影响叶绿体膜的状态,从而影响EFE的构象或者减少O_2^+的生成,抑制ACC的转化,衰老时细胞内的Ca^(2+)可启动钙信使系统,使O_2^+的产量升高,而其中膜脂过氧化是衰老的中心环节,因此O_2^+的升高可能是诱发衰老启动的重要因素。

ACC氧化酶基因在桑树水分和盐胁迫条件下的表达研究

为从分子水平上理解桑树在逆境胁迫中的应答机制，研究利用简并引物和RACE方法克隆了桑树氨基环丙烷羧酸（ACC）氧化酶基因部分序列，并初步分析了该基因在水分胁迫和盐胁迫下的表达模式。结果表明：克隆得到的桑树ACC氧化酶基因编码区与其它植物ACC氧化酶基因的同源性很高，与蔷薇科李属植物相似性高达85％～86％；该基因在水分胁迫下表达量增加，但个体之间表达量有差异，推测可能与个体抗旱性差异有关；在盐胁迫下，ACC氧化酶表达量变化不明显，同一桑树幼苗不同叶位之间有差异，推测是盐害引起组织死亡导致表达量发生变化，而非盐胁迫直接诱导，个体之间耐盐性的差异以及不同发育阶段的叶片对盐害的敏感程度不同，表达量变化也不同。

小苍兰ACC合成酶FhACS1基因的克隆与序列分析

以小苍兰品种"上农金皇后"为研究对象,利用PCR技术和染色体步移技术首次克隆到了ACC合成酶FhACS1基因的全长序列和编码序列。结果表明:FhACS1基因全长为2 576 bp,包含长为433 bp的5′端非编码区序列(5′-UTR)以及长为373 bp的3′端非编码区序列(3-′UTR);开放读码框(ORF)长度为1 371 bp,推定编码457个氨基酸。分析表明,该基因包含3个内含子和4个外显子。序列分析结果显示,FhACS1推导蛋白具备ACS蛋白的7个保守结构域;在氨基酸水平上,FhACS1与小果芭蕉的同源性最高(85%);系统进化分析表明,FhACS1与孟宗竹BaACS(BAC56949.1)、水稻OsACS1(AAA33888.1)、小果芭蕉MaACS1(AAQ13435)的亲缘关系最近。在其已知启动子区域,发现有多个对脱落酸、赤霉素、细胞分裂素等激素响应的顺式元件,以及对干旱和低温等逆境胁迫响应的顺式元件。

Fe^(2+)和CO_2对番木瓜ACC氧化酶活性的影响

１－氨基环丙烷－１－羧酸（ＡＣＣ）氧化酶催化ＡＣＣ氧化成为乙烯．通过ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和Ｐｈｅｎｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱层析后，ＡＣＣ氧化酶被纯化１９．５倍．在体外分析中，ＡＣＣ氧化酶活性被Ｆｅ２＋和ＣＯ２促进；Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋和Ｍｎ２＋抑制ＡＣＣ氧化酶的活性，但这种抑制效应能部分地被Ｆｅ２＋所拮抗．ＣＯ２对ＡＣＣ氧化酶活性的促进作用与反应体系中氧的浓度有关，在２１％的氧浓度下。

龙眼胚性愈伤组织ACC合成酶基因(DL-ACS1)的克隆及表达分析

以龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织为材料,采用同源克隆和RACE方法分离得到龙眼胚性愈伤组织乙烯合成限速酶DL-ACS1(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase)基因的cDNA全长序列(GenBank,FJ617537),共1 817 bp,包含了5'非编码区(73 bp),开放阅读框(1 437 bp),3'非编码区(307 bp)。该cDNA开放阅读框的氨基酸序列(含478个氨基酸)与其它植物ACS具有77%～63%同源性,属于ACC Synthase家族。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在龙眼体细胞胚胎(以下简称龙眼体胚)各阶段的表达量存在较大的时期差异,其中,球形胚(Stage 5)的表达量最高,鱼雷形胚(Stage 7)的表达量最低。