丝瓜ACC合成酶的原核表达、分离纯化及性质鉴定

将构建成功的丝瓜ACC合成酶cDNA的重组质粒,转化为大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后得到特异性高效表达,表达蛋白以包涵体形式存在.包涵体经洗涤和Zn2+螯合柱层析,得到纯化蛋白.SDS PAGE显示纯化蛋白分子量为55000的单一蛋白带.经活性分析,该酶最适pH值为8.5,米氏常数(Km)为44.2μmol/L.

大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白的研究

为了研究在大肠杆菌BL2 1(DE3)中重组蛋白的表达特点 ,探讨重组蛋白在大肠杆菌中表达时可溶性蛋白与包涵体出现的特点 ,从表达载体中表达了植物ACC合成酶 .经SDS PAGE电泳与双波长扫描分析 ,确定目的蛋白随表达时间、菌液密度的增加而增加 .但是其最佳表达时间为 2 5h ,菌液密度OD6 0 0 为 0 6 ,IPTG的最佳浓度为 0 6mmol L ,此时目的蛋白含量占全菌蛋白含量之比最高 .植物ACC合成酶在大肠杆菌中表达时以包涵体的形式存在 。

一种“高性价比”切胶纯化原核表达蛋白的方法

为建立一种低成本高效率的纯化表达蛋白的新方法,在保证不改变原有蛋白生物活性的前提下,以NaAc染色切胶纯化方法为参考,通过以KCl取代NaAc染色目的蛋白、反复冻融后快速离心等操作步骤取代原来的电泳后过夜透析等试验步骤。结果显示:最终使原试验时间至少缩短2/3,而且所得目的蛋白不存在浓度和纯度降低的问题。为许多条件有限的试验室进行纯化原核表达蛋白的研究提供了一种"性价比"更高的实用方法。

包涵体蛋白3种纯化方法的比较

目的比较3种纯化方法对表达的肠道病毒71型(EV71)VP1区包涵体蛋白的纯化效果。方法分别用差速离心法、固定化金属离子亲和层析(IMAC)及不同浓度饱和硫酸氨沉淀法3种包涵体蛋白纯化法对原核表达EV71 VP1包涵体蛋白进行纯化,蛋白垂直(SDS-PAGE)电泳检测蛋白纯化效果。结果差速离心法可以进行大批量表达蛋白纯化,纯化效果较好,但存在蛋白损失较多,且纯化蛋白不能反复冻融的问题。IMAC柱纯化获得的蛋白纯度较高,且蛋白性状稳定,但仍存在纯化蛋白量较少的问题。饱和硫酸氨沉淀纯化法无法获得纯度较高的包涵体蛋白。结论差速离心法可用于大批量蛋白纯化,纯化蛋白应避免反复冻融,可小量分装冻存后备用。IMAC柱纯化可获得纯度较高且性状相对稳定的纯化蛋白,其在相应抗体检测方法学的建立及疫苗制备方面均有广泛用途。饱和硫酸氨法只适用于表达蛋白的初步浓缩纯化。

质粒pGH/BL_(21)在大肠杆菌中表达条件的研究

目的 寻找质粒 pGH/BL2 1在大肠杆菌中的最佳表达条件。方法 当它在大肠杆菌中表达时 ,考查不同IPTG诱导浓度及不同的诱导时间对表达产物的影响 ,表达产物的量以SDS -PAGE电泳方法分析。结果 该基因的最佳表达条件为 :IPTG诱导浓度 1.0mmol/L ,诱导时间 4h。结论 IPTG对不同的基因在不同的表达体系中需不同的诱导条件 。