不同性别表型黄瓜基因组中雌性系特异的ACC合酶基因

利用一对引物 (引物 1和引物 2 )分别从雌性系黄瓜 (CucumissativusL .)品种“CORONA”、“DALEVE”和强雌性黄瓜品种“中农五号”、“欧洲八号”的基因组DNA中扩增到一长约 10 2 5bp的ACC合酶基因片段。序列分析表明 :该基因片段与Trebitsh等 1997年发表的ACC合酶基因片段的同源性大于 99% ,认为这两个基因片段应该是同一个基因 ,不同品种来源的该基因的相同性说明了其高度的保守性 ,并暗示了该基因在黄瓜性别决定中的重要作用。此基因片段与其他在不同诱导条件下表达的ACC合酶基因的同源性较低 (小于 70 % )。Southern分析表明此基因片段与黄瓜的性别表型有关 ,是雌性系黄瓜特有的。此基因的存在与黄瓜的雌性表达为“有”和“无”的关系 ,其拷贝数的多少与雌性表达强弱并无直接相关性 ,暗示在黄瓜中另有与雌性表达强弱有关的基因。

香蕉果实特异性ACC合酶基因启动子区的克隆及其功能初探

根据本实验室所获得的香蕉果实特异性ACC合酶cDNA序列 ,以改进的接头连接PCR方法通过两次步行从香蕉基因组中分别扩增并克隆了其基因 5′旁侧区近端 1 2kb和远端 1 6kb的片段。通过拼接 ,构建出含有2 5 0 5bp启动子区和转录起始位点下游 86bp的共 2 5 91bp的基因 5′旁侧区片段 ;其启发性动子区中 34至 2 8为推测的TATA盒序列 , 15 8至 146为推测的CCAAT盒 ,与其它植物基因启动子结构相类似。将 2 5kb启动子片段与 β 葡糖苷酸酶 (GUS)基因编码序列融合 ,用基因枪法将构建的嵌合基因转入香蕉叶、根和果实的细胞后 ,只在果实细胞中观察到报告基因的瞬时表达 ,从功能上证明了此 2 5kb的启动子片段具有指导报告基因在香蕉果实中特异性表达的作用。同时构建 5个含不同 5′端缺失启动子与GUS融合基因的表达载体。瞬时表达结果表明可能负责果实特异性表达的调控区存在于转录起始位点至 - 1111的启动子区中 ,而在 - 1111至 - 6 0

ACC合酶基因(ACSG)可能是黄瓜雌性系的分子标记(英文)

利用本实验室根据已知序列分离得到的ACC合酶基因 (ACSG)为探针对不同黄瓜 (CucumissativusL .)品种(系 )的基因组DNA进行Southern杂交 ,初步分析了该基因与黄瓜性别表型之间的相关性。发现在所检测的 10个不同品系中 ,ACSG与雌性系表型之间存在明显的相关关系 ,而且这种相关关系在不同的实验中具有良好的重复性。ACSG基因可能是鉴定黄瓜雌性系的一个分子标记。

桃ACC合酶基因的分离及其差异表达(英文)

利用 5′/ 3′RACEPCR技术 ,从桃 (Prunuspersica (L .)Batsch)果实中克隆了植物乙烯生物合成的关键酶———ACC合酶的全长cDNApacs,对pacs基因进行全序列测定表明 ,该基因全长 184 8个碱基 ,编码区为 14 4 9个碱基 ,5′端有 177个碱基的非编码区序列 ,3′端有 2 19个碱基的非编码区序列 (不包括终止密码子TAA)。pacs基因编码区共编码 4 83个氨基酸 ,蛋白质大小为 5 4kD ,等电点为 6 .4 3。pacs与番茄 (S196 77)、梅 (AB0 310 2 6 )、番木瓜 (U6 82 16 )、苹果(AB0 34993)等其他植物ACC合酶cDNA氨基酸序列同源性分别为 6 5 %、70 %、75 %、90 % ,并存在与这些ACC合酶氨基酸的活性位点保守序列SLSKDMGFPGFR。RT_PCR结合杂交分析表明 ,pacs和我们以前克隆的桃ACC合酶cDNApacs12 (AF4 6 7782 )在叶片和花中基因表达模式基本一致 ,伤处理和IAA均能诱导叶片pacs和pacs12基因的表达 ,但pacs在伤处理叶片的表达水平比pacs12高 ;pacs和pacs12基因在果实表达有所不同 ,pacs在绿熟和成熟果实中均有表达 ,而pacs12在绿熟果实中基本检测不到 ,在成熟果实中才有表达 ,两者在果实中的表达水平比伤处理和IAA处理叶片和花中要低。

在转基因烟草中表达番茄反义ACC合酶基因及其对芽再生的影响(英文)

利用从番茄(Lycopersicum esculentum Mill.)果实中分离到的ACC合酶cDNA,反向置于CaMV 35S启动子的控制之下,并转入烟草(Nicotiana tabacum L.)。PCR扩增证明此反义基因已整合到烟草的基因组上。Northern杂交及逆转录PCR分析表明,这种异源反义基因能在转基因烟草组织中表达,并抑制了烟草内源乙烯的合成,对乙烯合成的抑制在芽再生过程中更为明显,同时这也导致了转基因烟草在组织培养过程中芽再生能力的增强。这些结果从基因水平证明,乙烯在芽形成过程中具有重要的调控功能。

桃果实中ACC合酶基因克隆及基因沉默载体构建

植物中乙烯是一种具有促进果实成熟和衰老的内源激素。ACC合酶是植物乙烯生物合成途径中一个重要的限速酶,沉默ACC合酶基因的表达能减少植物性内源性乙烯的产生。以中华寿桃为研究材料,采用RT-PCR技术,克隆获得ACC合酶基因。将该基因酶切回收后连接到pTRV-RNA2载体上,转化DH5α,筛选阳性克隆,进行酶切鉴定。测序后与已知序列进行同源性比较,其同源性达到99%,表明将ACC合酶基因成功连接到pTRV-RNA2基因沉默载体上。

桃ACC合酶基因组DNA(pACSG01)的序列分析及其表达

以桃基因组DNA为模板 ,用套式PCR技术扩增并克隆了桃ACC合酶基因片段 ,将其克隆 (定名为pACSG0 1)并进行序列测定 ,表明该片段全长 132 0bp ,并富含HindⅢ和EcoRI位点 ,与其它ACC合酶基因结构序列有一定的相似性 ,内含两个内含子 ,编码的氨基酸序列与已克隆桃ACC合酶cDNA推导的氨基酸序列的同源性分别为 5 7.4%和5 6 .8%.pACSG0 1与我们已克隆的两个桃ACC合酶cDNA基因表达有所不同 ,RNA点杂交和RT -PCR结合Southern杂交分析表明 ,该基因在成熟和乙烯处理的果实均不表达 ,伤处理、LiCl和生长素处理也不能诱导该基因的表达 ,在衰老花瓣中也不表达 .图 3参

不同性别类型黄瓜ACC合酶基因的单核苷酸多态性标记和酶切扩增长度多态性标记

黄瓜的性别分化与乙烯密切相关,1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合酶是乙烯生物合成过程中的关键酶.根据ACC合酶基因家族的保守序列设计PCR引物,从8个不同性别类型(雌雄同株、强雌性和全雌性)黄瓜品种中克隆了长度为1188bp的ACC合酶基因(CS-ACS2)片段(GenBank登记号为:DQ115884～DQ115886和DQ115875～DQ115879).经测序分析,3个雌雄同株性别类型品种的序列完全相同.与之相比,5个强雌性和全雌性品种中存在8个单核苷酸多态性(SNPs)标记,SNPs标记为4个A←→G和4个T←→C之间的转换.在8个SNPs中,有1个SNP位于内含子区域,其余7个SNPs都位于外显子区域.在7个位于外显子区域的SNPs中,有3个为非编码区的SNPs,4个为cSNPs.而在4个cSNPs中,有3个导致了编码的氨基酸序列改变.研究结果表明,与雌雄同株性别类型相比,雌性系中均存在单核苷酸的变异,这提示ACC合酶基因CS-ACS2的单核苷酸变异可能与黄瓜雌性系的发生形成有关.另一方面,根据SNP多态性还发展了一个酶切扩增长度多态性(CAPS)标记C-MT700.利用CAPS标记C-MT700能将强雌性优良品种MT-705与其他黄瓜品种相区别,该标记在黄瓜育种生产上具有一定的应用价值.此外,研究获得的SNPs标记和CAPS标记丰富了黄瓜的分子标记种类.

ACC合酶反义基因转化洋桔梗Double Mariachi Pink的研究

以洋桔梗(Eustoma grandiflorum)品种Double Mariachi Pink为试验材料,在已建立的洋桔梗高频再生体系和高效稳定遗传转化体系的基础上,将PBI121-ACC合酶反义基因片段(1 008 bp)通过农杆菌介导法转化洋桔梗,通过高频再生获得116株抗性苗。再生抗性苗在生根培养基1/2MS+NAA 0.1 mg/L+Km 15 mg/L上生根筛选获得了55株正常生根的植株;对其中随机挑选的8个株系进行PCR鉴定和GUS表达检测,在增殖筛选培养基MS+6-BA0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+Km 30 mg/L+Cb 100 mg/L上初步筛得到5个PCR阳性株系,其中4株GUS检测呈阳性:5个PCR阳性株系经PCR-Southern杂交鉴定得到1株阳性植株。将阳性株系出瓶移栽,其平均花期为24 d。

番茄ACC_2合酶基因5’端前导序列的改造及特异表达分析

利用番茄LE—ACC25'-端2.0kb前导序列中第-1144位和第-166位的2个BglII位点,综合Rottmann和宋俊歧等对LE—ACC25'端2.0kb前导序列的功能区鉴定和分析结果,以删除、替代等方式构建了5种改造型的果实特异表达启动子,并进一步完成了6种(其中1种为全长序列)GUS基因植物表达载体的构建,用基因枪法和根癌农杆菌介导的叶盘共培养法转化番茄叶片、番茄和番木瓜成熟果实,通过GUS的组织化学分析和RNAdotblot分子杂交技术对转化结果作表达分析。结果表明,6种启动子均能启动GUS基因在果实中的表达,在番木瓜果实中的表达水平基本一致。

桃果实ACC合酶cDNA的克隆

根据其它植物ACC合酶氨基酸保守区设计两组简并引物 ,用套式PCR技术从桃成熟果实cDNA中扩增出 1.1kb大小特异性片段 ,将其克隆至pGEM T载体上 ,对重组克隆pPACSI进行全序列测定表明 ,插入片段全长 110 0个碱基 ,编码 36 6个氨基酸 ,该基因与番茄、笋瓜、小西葫芦、康乃馨、苹果ACC合酶cDNA氨基酸序列同源性分别为 72 .7% ,71.3% ,71.1% ,6 9.1% ,6 5.4 %。RNA点杂交表明pPACSI基因随着桃果实成熟表达活性增强 ,乙烯处理能诱导桃果实该基因的表达。

乙烯和1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶基因参与玫瑰花发育过程中细胞程序化死亡的调控(英文)

作为植物有性繁殖器官——花的花瓣通常生命周期短,其中有一个敏感的、严格控制的细胞程序化死亡过程。为了揭示细胞程序化死亡过程中发生的反应或者其组成成分,解释玫瑰花发育过程中的细胞程序化死亡过程的机理,测定了在整个花发育过程中玫瑰花瓣的乙烯释放速率、ACC合酶基因的转录产物(mRNA)、ACC合酶活性以及ACC含量。结果显示在花发育过程前期(阶段1、2)检测不到乙烯产生,在花瓣完全绽开时花瓣中乙烯开始产生。在花发育后期(阶段4、5)花的衰老与乙烯释放速率的升高同时发生。在花发育前期没有ACC合酶基因的转录产物积累,该基因在花瓣完全绽开时开始表达,在花发育后期逐渐增强。ACC合酶活性与ACC含量的变化趋势与乙烯的一致。在玫瑰花发育后期乙烯诱导和调控花瓣的细胞程序化死亡。ACC合酶基因、ACC合酶以及ACC都是玫瑰花瓣程序化死亡过程中的重要调控因子。

黄瓜性别基因连锁的分子标记筛选

利用RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)技术对黄瓜性别特异基因进行分子标记连锁研究。共选用 30 0个 1 0碱基的随机引物按BSA法对黄瓜性别表型分离群体进行PCR扩增 ,筛选出 5个在全雌和弱雌株基因池 (genepool)中表现多态性的引物。单株检测表明 ,引物B1 1具有全雌特异性 ,在检测的大多数全雌性单株中均可扩增出一条约 1 0 0 0bp的特征带。而在雌雄同株的单株中则未见。因此 ,将该全雌性特异的片段命名为B1 1 1 0 0 0 。该标记的获得为黄瓜性别特异基因的分离和克隆奠定了基础。另外 ,以ACC合酶基因 (CS ACS1 )特异引物检测分离群体单株 ,发现该酶基因存在于所有性型的单株中 。

黄瓜性别决定相关基因在不同性型黄瓜种质基因组中的分布

根据已有的决定黄瓜雌性的ACC合酶基因CS-ACS1G,与黄瓜性型有关的ACC氧化酶基因CS-ACO2、CS-ACO3,与黄瓜雌性相关的乙烯受体基因CS-ETR2和CS-ERS的序列,通过设计特异引物,对不同性型黄瓜品种基因组DNA进行扩增。结果表明,5个基因在本试验所用的不同性型黄瓜品种的基因组中均能被检测到,说明这5个性别决定相关基因在本试验中不具有雌性特异性。通过PCR克隆在全雌性黄瓜品种G5224中获得了长度为1124bp的ACC合酶基因序列。BLAST分析表明,本试验所获得的ACC合酶基因序列和Trebitsh公布的CS-ACS1G基因序列的同源程度为99%,表明PCR扩增产物确实为CS-ACS1G基因。此基因在基因组中表现不具雌性特异性的现象与多数研究者的结论相悖。

黄瓜性别决定基因相关的分子标记

以不同性别类型的黄瓜高代自交系为材料,根据GenBank中提供的乙烯合成、信号转导有关基因序列、花器官发育相关的黄瓜性别决定蛋白基因、AGMOUS同源异型基因、与性别表达相关的RAPD和ISSR引物,采用Primer Premier 5.00专业引物设计软件,设计可能与性别表达有关特异引物.结果表明,ACS1号引物对(ACS-F1,5′-ATTCAGATGGGT-3′;ACCS-R1,5′-GCCAAAGCTCGACAT-3′),CsACS1G-SCAR引物对(ACS-F1,5′-TTAACTACTTCGGACGGGCATAG-3′;ACCS-R1,5′-AGGTGTTCAGCAAA CATAGGGTG-3′)及RAPD引物S12对不同性别类型的黄瓜基因组DNA的PCR扩增产物表现出明显的多态性.用Mapmaker/Exp 3.0进行连锁分析,发现雌性F基因和ACS_280,CsACS1G-SCAR_430均连锁群,遗传距离分别为31.4,10.0 cM,与S12_280标记不在一个连锁群上.

乙烯引发真菌侵袭

许多采摘后发生的果实病害都是由潜伏的真菌在果实成熟时引发的。那么,真菌怎么知道该何时发起攻击呢?一项新的研究表明,是刺激果实成熟的乙烯使真菌产生附着胞,刺透果实表皮。美国Ohio州立大学的Moshe A.Flaishmen和Pappachan E.Kolattukudy监测了多种成熟果实对附着在显微镜玻片上的真菌刺盘孢孢子的影响。他们发现番茄、颚梨和香蕉促使附着胞产生,但柑桔不然。柑桔是无呼吸峰果实,即在成熟过程中不产生乙烯。另外,带有反义ACC合酶基因的转基因番茄(不产生乙烯)