甘蔗ACC氧化酶基因片段的克隆与序列分析

1 -氨基环丙烷 - 1-羧酸 (ACC)氧化酶是植物乙烯合成的一个关键酶 ,乙烯作为一种内源激素 ,对植物生长、老熟过程有多方面的调节作用。根据报道的各种植物ACC氧化酶氨基酸序列上前后两个保守区设计两个简并引物 ,以甘蔗总DNA为模板 ,通过PCR扩增到一个 940bp的基因片段。将片段序列在NCBI的BLAST软件上进行同源性搜寻 ,显示的 63个序列全部是ACC氧化酶基因 ,因而认为克隆到的片段就是甘蔗ACC氧化酶基因的一个成员。经对不同植物来源的ACC氧化酶基因家族进行比较分析 ,去除一个 10 3bp的“内含子”后 ,推导的氨基酸序列为 2 79个残基 ,占推测全长氨基酸残基总数的 86%左右。经同源性分析 ,序列与毛竹和水稻ACC氧化酶的同源率达到 86%。系统进化分析表明 ,该序列最先与水稻、其次和香蕉的ACC氧化酶聚类 ,然后再与双子叶植物的ACC氧化酶聚类 ,符合按形态特征分类的血缘关系。基因的获得对下一步了解乙烯的合成表达与甘蔗生长。

酸橙ACC氧化酶基因片段克隆及序列分析

1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)氧化酶是植物乙烯合成的1个关键酶,乙烯作为一种内源激素,对植物生长、老熟过程有多方面的调节作用。根据已报道的各种植物ACC氧化酶氨基酸序列上前后两个保守区设计1对简并引物,以酸橙叶片总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到1个834 bp的基因片段。克隆了酸橙1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)氧化酶基因cDNA片段,将片段序列在NCB I网站上进行同源性搜索,显示的皆为不同植物的ACC氧化酶基因,因而认为所克隆的片段就是酸橙ACC氧化酶基因;并运用DNAStar5.0软件进行序列分析,推导的氨基酸序列为278个残基;具有所有植物ACC氧化酶基因共有的保守区域;与多种植物的ACC氧化酶基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性都在72%和70%以上。

河套蜜瓜ACC氧化酶基因cDNA部分片段的克隆和序列分析

以河套蜜瓜(CucumismeloL.cvHetao)成熟果实为材料,用硫氰酸胍法提取总RNA,以oligo(dT)15为引物,反转录合成cDNA,利用一对甜瓜ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylateoxidase,ACO)基因cDNA的特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,获得了预期大小的cDNA片段.将此片段克隆于pUC19质粒中,进行DNA序列分析.序列分析结果表明该片段为545bp,编码甜瓜ACO的第126至第306个氨基酸.该河套蜜瓜ACO基因cDNA序列与Andes甜瓜、Cantaloupcharentais甜瓜和哈密瓜的相应序列进行比较,其核苷酸序列与Andes甜瓜的同源性为99.4%;与Cantaloupcharentais甜瓜和哈密瓜的同源性均为99.6%,与其对应的氨基酸序列的同源性均为99.4%.

花椰菜ACC氧化酶基因的克隆及其RNAi对内源基因表达的抑制作用

根据亲缘关系较近的几种作物ACC氧化酶氨基酸序列,设计一对简并引物,从花椰菜(Brassicaoleraceavar.botrytis)基因组中获得长1202bp的候选片段。序列分析表明该基因含有3个外显子(Exon)、2个内含子(Intron),编码区序列长756bp,编码252个氨基酸。同源性分析发现其与青花菜(Brassicaoleraceavar.Italica)上已发表mRNA序列同源率为99%(GenBank序列号:X81629),推断该基因为花椰菜ACC氧化酶基因,命名为BoACO(GenBank登录号:AY676466)。在此基础上,用BP克隆的方法构建BoACO的RNA干涉(RNAi)载体pHBACO,对花椰菜进行遗传转化,获得卡那霉素抗性转化植株5棵,分子检测证实外源片段成功导入其中3棵花椰菜基因组中。Northern杂交分析显示:转基因植株内源ACO基因转录的mRNA被降解。ACC氧化酶活性分析进一步表明,外源基因的导入大大地降低了ACC氧化酶活性。

桃ACC氧化酶基因的克隆和植物表达载体的构建

以‘玉露’桃叶片基因组ＤＮＡ为模板，用ＡＣＣ氧化酶基因特异寡聚核苷酸为引物进行ＰＣＲ扩增，得到１．３ｋｂ左右的扩增产物，将其克隆到ｐＵＣ１９加Ｔ载体上，组建亚克隆并进行序列测定，结果表明，该基因全长有１２８８个碱基，由４个外显子和３个内含子组成。外显子由９５７碱基组成，编码３１９个氨基酸。该基因与桃、番茄、矮牵牛、康乃馨、苹果ＡＣＣ氧化酶ｃＤＮＡ氨基酸序列同源性分别为９９．３％，８３．０％，７６．８％，７４．０％，７５．０％。ＲＮＡ点杂交表明，该基因在未成熟果实检测不到杂交信号，随着成熟度增加，硬度下降，基因表达增强。将ＡＣＣ氧化酶基因分别正向和反向克隆到植物表达载体ｐＢＩ１２１中，并通过酶切分析，ＰＣＲ和点杂交鉴定重组质粒正确。将重组表达质粒导入根癌农杆菌中，经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定证实质粒已被导入。

反义ACC氧化酶基因的导入对番茄乙烯生成的抑制作用

将反向克隆的ＡＣＣ氧化酶基因通过Ｔｉ质粒导入到番茄基因组中，转基因番茄植株叶片和果实中ＡＣＣ氧化酶活性和乙烯产生速率均受到显著抑制，显示出反义基因能抑制靶基因（ＡＣＣ氧化酶）的表达。子代抗性标记基因的分离结果表明呈单基因遗传。

香石竹ACC氧化酶基因的克隆与植物表达载体构建

根据已发表的ACO核苷酸序列 ,设计一对引物 ,以香石竹品种‘American’基因组DNA为模板 ,扩增出香石竹ACC氧化酶基因 ,将其连接到pMD18加T质粒载体上 ,通过中间载体pBluescriptSK ,构建了ACO基因正向和反向插入的植物表达载体 ,并将其导入了农杆菌。酶切检测表明该片段已插入表达载体 ,序列测定结果显示所克隆基因片段含 3个外显子 ,2个内含子 ,其中

康乃馨ACC氧化酶反义基因遗传转化康乃馨的研究

在建立康乃馨从愈伤组织到完整植株的高频再生体系的基础上,用花特异表达启动子驱动的康乃馨ACC氧化酶反义基因通过农杆菌介导法对康乃馨进行遗传转化,获得了3株转基因植株,经多重PCR及PCR-Southem杂交检测,证实康乃馨ACC氧化酶的反义基因已整合进康乃馨的基因组中。

百合ACC氧化酶基因全长cDNA的克隆及序列分析

以亚洲百合‘Polyanna’（Lilium spp．）花瓣为材料，根据已报道的百合ACC氧化酶基因片段设计1对末端扩增特异引物，采用RACE方法，获得百合ACC氧化酶基因的全长eDNA（GenBank登录号为EU296623）。该eDNA全长1152bp，具有一个954bp的开放阅读框，编码318个氨基酸。Blast搜索结果显示，百合ACC氧化酶基因核苷酸序列与其它植物已报道的ACC氧化酶基因具有71％～82％的相似性，氨基酸序列有70％～87％的相似性，聚类分析表明，与单子叶植物百合科郁金香首先聚类，其次与双子叶植物聚类，最后与单子叶禾本科和兰科植物聚类。

甜瓜ACC氧化酶反义基因植物表达载体的构建及转化烟草的研究

用限制性内切酶从目的基因供体质粒pBI-aACO1上切下大小约2.3kb的目的基因,将其定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,构建成含有GUS基因的甜瓜ACC氧化酶反义基因植物表达载体pCB-aACO1.采用直接转化法将pCB-aACO1导入根癌农杆菌菌株EHA105,并用新构建的工程菌对普通烟草进行了遗传转化研究.在Kanamycin选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经过GUS基因组织化学法检测以及PCR方法鉴定,证实了该反义基因已导入烟草基因组中.此项研究为下一阶段用该反义基因转化甜瓜品种以改良甜瓜果实耐贮运性打下基础.

龙眼胚性愈伤组织ACC氧化酶基因的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

【目的】分离克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织乙烯合成关键酶ACO(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase)基因,并分析该基因在龙眼体细胞胚胎(以下简称龙眼体胚)发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,获得龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA全长序列和DNA序列,运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR(q-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达【。结果】克隆得到龙眼胚性愈伤组织ACO基因1315bp的cDNA全长序列(GenBank登录号为FJ534854),该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列(含315个氨基酸)与其它植物ACO具有86%-47%同源性,包含了5'非编码区为86bp,3'非编码区为281bp,3'poly(A)尾长13bp;该基因的DNA序列(GenBank登录号为GU123929)长为1660bp,包含3个内含子,内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则;该基因在龙眼体胚各阶段均有表达,整个变化趋势呈字母"M"状。【结论】确定所获得的序列是龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA序列和DNA全长序列;该基因在不完全胚性紧实结构和心形胚的表达量为两个峰值。

茶树ACC氧化酶基因全长cDNA的克隆与表达分析

ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)氧化酶是植物乙烯合成过程中的关键酶之一,对乙烯的合成具有重要的调控作用。在茶树新梢cDNA文库测序所获得ESTs基础上,利用RT-PCR技术,克隆得到编码ACC氧化酶基因的全长序列,GenBank登录号为DQ904328。该基因长1232bp,编码320个氨基酸残基,预测分子量为36.2kD,等电点5.41。多序列联配表明茶树ACC氧化酶具有高度保守区域,基于邻接法的进化树显示与柿树ACC氧化酶的亲缘关系最近。对经高、低温后的不同品种进行RT-PCR分析,结果发现ACC氧化酶基因的表达量与品种的抗逆性有一定的相关性。

冬枣两个ACC氧化酶基因的cDNA克隆及其表达模式

根据植物ACC氧化酶(ACO)家族的氨基酸和核苷酸保守区序列设计简并引物,采用3′RACE技术从半红期冬枣果实中分离了两个ACO同源基因片段,随后通过PCR技术进一步获得了两个包含完整开放阅读框(ORF)及3′端非编码区(UTR)序列的ACO基因的cDNA,即ZjACO1和ZjACO2。两个基因序列在GenBank中的登录号为EU216549和EU216550,其大小分别为1115bp和1105bp,编码蛋白大小分别为319个和321个氨基酸。ZjACO1和ZjACO2在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为79.4%和84.0%。Northern杂交结果表明,这两个基因在冬枣叶片中不表达,在果实不同发育阶段中的表达具有明显差异。

ACC氧化酶基因研究进展

乙烯作为植物的五大类激素之一,在植物的生长发育过程中发挥着重要作用.而乙烯在植物体内的生物合成主要是由ACC合成酶和ACC氧化酶这2个限速酶来控制的,通过调节它们的表达能有效地调节乙烯的合成量.本文就ACC氧化酶基因克隆及表达调控进行了综述,并对其应用前景进行了展望.

狗头枣ACC I氧化酶基因的克隆及其序列分析

为利用RNAi技术开展调控乙烯合成延迟狗头枣果实成熟等研究,以狗头枣试管苗叶片的总DNA为模板,根据冬枣ACC I氧化酶基因的序列设计引物,通过PCR方法获得一长1 294 bp片段,序列分析结果表明,该片段具有4个外显子和3个内含,依次在106～201、430～541 bp与877～1 002 bp碱基处.此序列与冬枣ACC I氧化酶基因（EU216549.1）的核苷酸和氨基酸序列同源性均为99.69％,表明成功地克隆了狗头枣ACC I氧化酶基因.

农杆菌介导的ACC氧化酶反义基因转化甜瓜品种河套蜜瓜的研究

将从甜瓜品种河套蜜瓜中克隆的ACC氧化酶基因cDNA片段反向构建到植物表达载体pROKⅡ中，获得重组质粒pRACO1，用三亲融合法将其导入根癌农杆菌LBA4404中，转化河套蜜瓜子叶外植体，在芽诱导培养基MS＋IAA0．8mg／L＋BA1．0mg／L＋ABA0．26mg／L＋Cef500mg／L＋Kan75mg／L中诱导生芽，待芽长到2cm左右转入MS＋IBA0．5mg／L＋Cef300mg／L＋Kan50mg／L的培养基中诱导生根，1～2周后可诱导产生大量的根，形成完整的转化小植株．经PCR检测证明，目的基因已整合到河套蜜瓜的基因组中．

樱桃ACC氧化酶基因的克隆和序列分析

以樱桃基因组DNA为模板定向克隆其ACC氧化酶基因。对PCR扩增的目的片段用 1%琼脂糖凝胶电泳检测后 ,进行回收、连续转化 ,通过蓝白筛选挑取白色菌落提取质粒DNA进行酶切鉴定 ,确定重组子后采用双脱氧终止法测定DNA全序列。DNA测序结果显示 ,樱桃的ACC氧化酶基因序列全长为 1310bp ,由 2个外显子和 3个内含子构成 ,外显子总长为 10 0 0bp。同源性分析可知 ,樱桃与桃的ACC氧化酶基因DNA序列同源性达 97 8%。

香石竹ACC氧化酶基因克隆及其反义表达载体构建

据已报道的香石竹氨基环丙烷羧酸(ACC)氧化酶基因的cDNA序列设计特异引物,以香石竹品种“Master”基因组DNA为模板,用PCR方法克隆出香石竹ACO基因的部分序列。测序结果显示,克隆的序列与已报道序列基本一致。将克隆的香石竹ACO片段反向连接到植物表达载体pCAMBIA 1301中CaMV 35S启动子的下游,构建了香石竹ACO基因的反义表达载体pCAM-ACO2,为进一步通过反义技术延长转基因香石竹的花期奠定了基础。

香石竹ACC氧化酶重复基因植物表达载体的构建及转基因植株的获得

香石竹ACC氧化酶基因从核NDA中克隆之后,将其首先构建成正义及反义的单拷贝植物表达载体,在此基础上又同向插入一个ACO基因片段,从而获得ACO的正义重复基因和反义重复基因植物表达载体,所得载体已通过酶切分析和PCR鉴定。将该表达载体导入根癌农杆菌LBA4404菌株,并转化香石竹品种Master、爱卡迪幼叶,经PCR检测和Southern杂交鉴定,获得了8株转化植珠。

农杆菌介导法将ACC合成酶和氧化酶反义基因转入日本甜柿的研究

以日本甜柿品种次郎(Diospyros kaki Thunb.cv.Jirou)的叶片为外植体,通过农杆菌介导法,建立了次郎柿遗传转化体系。结果表明,菌液OD600值为0.6,乙酰丁香酮浓度为200mg·L-1,筛选培养3d,头孢霉素为300mg·L-1的转化率最高。在此条件下,将ACC合成酶和氧化酶的反义联合基因导入到次郎柿的组培苗中,经PCR检测,得到了8株转基因植株。