番茄ACC合酶反义基因对河套蜜瓜的转化

河套蜜瓜（CucumismeloLcvHetau）的子叶经预培养。芽诱导和生根培养，获得再生小植株，诱导率达58％。取带有番茄ACC合酶反义基因的双元载体pMQ6／JM109与农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）LBA4404经三亲融合后，与在MS0上萌发5d、并在MS＋1mg／LNAA培养基上预培养3d的子叶共培养48h，然后转入含50mg／L卡那霉素的MS＋6mg／LZT的芽诱导培养基中，1l个月后诱导生芽，待芽长1．5－2cm时转入生根培养基中，1－2周后可诱导产生大量的根，形成完整的转基因小植株。经PCR和分子杂交检测证明，目的基因已整合入河套蜜瓜的基因组中。

通过表达ACC脱氨酶基因控制番茄果实的成熟

乙烯在跃变型果实的成熟过程中起着触发呼吸跃变和促进果实成熟的作用。细菌来源的１氨基环丙烷１羧酸（ＡＣＣ）脱氨酶能降解乙烯的直接前体ＡＣＣ，从而抑制植物体内乙烯的合成。我们用ＰＣＲ方法从假单孢杆菌中克隆到ＡＣＣ脱氨酶基因并通过农杆菌介导的方法将其转入番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）中。再生植株经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测证明，ＡＣＣ脱氨酶基因已整合到番茄基因组中并稳定表达。转基因番茄果实成熟期的推迟时间与体内乙烯的抑制程度有相关性。转基因番茄植株乙烯的合成降低８０％左右，果实在离体条件下可保鲜７５ｄ左右。研究ＡＣＣ脱氢酶基因在植物体内的作用可阐明高等植物体内乙烯的作用机理并为培育耐贮藏果蔬品种打下基础。

不同性别表型黄瓜基因组中雌性系特异的ACC合酶基因

利用一对引物 (引物 1和引物 2 )分别从雌性系黄瓜 (CucumissativusL .)品种“CORONA”、“DALEVE”和强雌性黄瓜品种“中农五号”、“欧洲八号”的基因组DNA中扩增到一长约 10 2 5bp的ACC合酶基因片段。序列分析表明 :该基因片段与Trebitsh等 1997年发表的ACC合酶基因片段的同源性大于 99% ,认为这两个基因片段应该是同一个基因 ,不同品种来源的该基因的相同性说明了其高度的保守性 ,并暗示了该基因在黄瓜性别决定中的重要作用。此基因片段与其他在不同诱导条件下表达的ACC合酶基因的同源性较低 (小于 70 % )。Southern分析表明此基因片段与黄瓜的性别表型有关 ,是雌性系黄瓜特有的。此基因的存在与黄瓜的雌性表达为“有”和“无”的关系 ,其拷贝数的多少与雌性表达强弱并无直接相关性 ,暗示在黄瓜中另有与雌性表达强弱有关的基因。

ACC合酶cDNA克隆及其对美洲黑杨体内乙烯产生的反义抑制

利用ＲＴＰＣＲ技术克隆了大豆ＡＣＣ合酶基因ＧＭＣＡＣＣＳＩ编码区１５ｋｂ的ｃＤＮＡ片段，经酶切图谱分析和序列分析鉴定后，反向插入到２元载体ｐＢｉｎ４３８中，构建了表达ＡＣＣ合酶反义ＲＮＡ的植物表达载体，转化农杆菌后用该农杆菌侵染美洲黑杨叶片，在含卡那霉素的ＭＳ培养基上选择转化子和植株再生，通过ＰＣＲ检测从抗卡那植株中选到１５株转基因植株，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析初步确证了外源基因是以单拷贝插入到杨树基因组ＤＮＡ中；对杨树幼苗乙烯释放的测定结果表明转基因杨树幼苗的乙烯释放量为对照的２２％。

香蕉果实特异性ACC合酶的cDNA克隆及序列分析

根据ACC合酶高度保守区氨基酸序列设计两种兼并引物。通过RTPCR,克隆了香蕉果肉ACC合酶1693bp的cDNA片段。再根据其序列测定结果进行5′RACE(RapidamplificationofcDNAends)。最终确定香蕉果肉中ACC合酶的mRNA全长为1752个核苷酸。其中5′非翻译区74个核苷酸,编码区1461个核苷酸,3′非翻译区217个核苷酸,编码产物为486个氨基酸。通过Northern杂交分析。

乙烯利诱导甘蔗ACC合成酶基因家族三成员在茎中表达与乙烯释放量和糖分积累的关系

ACC合酶(ACS)是高等植物乙烯生物合成途径中的限速酶。为明确ACS基因在甘蔗茎中的表达与乙烯释放量、蔗糖积累的关系,在克隆到甘蔗ACS基因3个成员(Sc-ACS1、Sc-ACS2和Sc-ACS3)的基础上,分别以它们作为探针,Northern杂交检验其在茎中的时空表达。结果表明,甘蔗生长后期,ACS基因3个成员在茎中不同品种和节间持续表达,Sc-ACS1和Sc-ACS2表达维持较低水平,Sc-ACS3维持较高水平。乙烯利处理明显提高3个基因在茎的未成熟和正在成熟节间的表达,且Sc-ACS1和Sc-ACS2在未成熟节间的表达持续时间长达一个月,而Sc-ACS3在未成熟节间的较高水平表达可持续45d。该结果与甘蔗节间尤其是未成熟和正在成熟节间的乙烯释放量增加以及糖分积累的效应基本一致。相关分析表明,桂糖17品种乙烯释放量与蔗糖分在处理后14d和28d分别极显著和显著负相关,但巴西固氮品种B1未达显著水平。

香蕉果实特异性ACC合酶基因启动子区的克隆及其功能初探

根据本实验室所获得的香蕉果实特异性ACC合酶cDNA序列 ,以改进的接头连接PCR方法通过两次步行从香蕉基因组中分别扩增并克隆了其基因 5′旁侧区近端 1 2kb和远端 1 6kb的片段。通过拼接 ,构建出含有2 5 0 5bp启动子区和转录起始位点下游 86bp的共 2 5 91bp的基因 5′旁侧区片段 ;其启发性动子区中 34至 2 8为推测的TATA盒序列 , 15 8至 146为推测的CCAAT盒 ,与其它植物基因启动子结构相类似。将 2 5kb启动子片段与 β 葡糖苷酸酶 (GUS)基因编码序列融合 ,用基因枪法将构建的嵌合基因转入香蕉叶、根和果实的细胞后 ,只在果实细胞中观察到报告基因的瞬时表达 ,从功能上证明了此 2 5kb的启动子片段具有指导报告基因在香蕉果实中特异性表达的作用。同时构建 5个含不同 5′端缺失启动子与GUS融合基因的表达载体。瞬时表达结果表明可能负责果实特异性表达的调控区存在于转录起始位点至 - 1111的启动子区中 ,而在 - 1111至 - 6 0

桃果实ACC合酶cDNA的克隆

根据其它植物ACC合酶氨基酸保守区设计两组简并引物 ,用套式PCR技术从桃成熟果实cDNA中扩增出 1.1kb大小特异性片段 ,将其克隆至pGEM T载体上 ,对重组克隆pPACSI进行全序列测定表明 ,插入片段全长 110 0个碱基 ,编码 36 6个氨基酸 ,该基因与番茄、笋瓜、小西葫芦、康乃馨、苹果ACC合酶cDNA氨基酸序列同源性分别为 72 .7% ,71.3% ,71.1% ,6 9.1% ,6 5.4 %。RNA点杂交表明pPACSI基因随着桃果实成熟表达活性增强 ,乙烯处理能诱导桃果实该基因的表达。

抑制ACC合酶和ACC氧化酶对植物贮藏保鲜的影响

乙烯在植物成熟过程中起着重要的作用。ACC合酶和ACC氧化酶是植物乙烯生物合成的限速酶,在调节乙烯生物合成中起关键作用。本文从基因克隆及表达调控方面综述了ACC合酶和ACC氧化酶分子生物学研究进展,并介绍了抑制ACC合酶和ACC氧化酶对植物乙烯生物合成和花卉保鲜及果蔬贮藏的影响。

哈密瓜转ACC脱氨酶基因再生植株的获得

ACC脱氨酶基因表达产物具有减少植物乙烯合成的作用 ,从而达到果实保鲜耐贮的目的。用农杆菌侵染三种哈密瓜 (皇后、迦师瓜、红蜜脆 )培养 8d的子叶块 ,接种在MS附加BA1.0mg/L ,Kana(卡那霉素 ) 75mg/L和Amp(氨苄青霉素 ) 2 0 0mg/L的培养基上 ,在温度 (2 7± 1)℃、光照 2 0 0 0lx条件下 ,经 2 0d左右培养出现不定芽的分化 ;继续将这些不定芽接种在MS附加IBA0 .1mg/L ,Kana 5 0mg/L和Amp 2 0 0mg/L的培养基上 ,诱导根的产生 ,最终获得了转化植株。通过对转化植株的PCR扩增检测证明 ,1kb的ACC脱氨酶基因已经整合到哈密瓜基因组中。

ACC合酶反义基因转化洋桔梗Double Mariachi Pink的研究

以洋桔梗(Eustoma grandiflorum)品种Double Mariachi Pink为试验材料,在已建立的洋桔梗高频再生体系和高效稳定遗传转化体系的基础上,将PBI121-ACC合酶反义基因片段(1 008 bp)通过农杆菌介导法转化洋桔梗,通过高频再生获得116株抗性苗。再生抗性苗在生根培养基1/2MS+NAA 0.1 mg/L+Km 15 mg/L上生根筛选获得了55株正常生根的植株;对其中随机挑选的8个株系进行PCR鉴定和GUS表达检测,在增殖筛选培养基MS+6-BA0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+Km 30 mg/L+Cb 100 mg/L上初步筛得到5个PCR阳性株系,其中4株GUS检测呈阳性:5个PCR阳性株系经PCR-Southern杂交鉴定得到1株阳性植株。将阳性株系出瓶移栽,其平均花期为24 d。

超氧阴离子自由基对绿豆黄化幼苗ACC合酶的影响

以0.5、5和50mmol/L的连二亚硫酸钠(Na2S2O4)为外源超氧阴离子自由基(O2ˉ·nim 02理处,源)能明显提高绿豆黄化幼苗ACC合酶(ACC synthase, ACS, EC 4.4.1.14)的活性。超氧阴离子自由基的特异性清除剂超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和1,4-二氮杂二环(2,2,2)辛烷[1,4-diazabicyclo(2,2,2) Octane, DABCO]能抑制Na2S2O4的这种作用,显示Na2S2O4产生的O2ˉ·引起了ACC合酶活性的升高。但Na2S2O4处理较长时间,ACC合酶活性开始下降,处理60 min的ACC合酶活性明显低于对照,SOD和DABCO的加入有助于抑制ACC合酶活性的降低,表明超氧阴离子自由基对ACC合酶活性具有促进和抑制作用并存的“双重性”影响。研究表明,外源Na2S2O4处理20 min能明显降低以S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)为底物的ACC合酶的Km值,处理60 min反而提高了ACC合酶的Km值,表明O2ˉ·是通过改变ACC合酶对底物SAM的亲和力,从而影响其活性的。

桃果实中ACC合酶基因克隆及基因沉默载体构建

植物中乙烯是一种具有促进果实成熟和衰老的内源激素。ACC合酶是植物乙烯生物合成途径中一个重要的限速酶,沉默ACC合酶基因的表达能减少植物性内源性乙烯的产生。以中华寿桃为研究材料,采用RT-PCR技术,克隆获得ACC合酶基因。将该基因酶切回收后连接到pTRV-RNA2载体上,转化DH5α,筛选阳性克隆,进行酶切鉴定。测序后与已知序列进行同源性比较,其同源性达到99%,表明将ACC合酶基因成功连接到pTRV-RNA2基因沉默载体上。

不同性别类型黄瓜ACC合酶基因的单核苷酸多态性标记和酶切扩增长度多态性标记

黄瓜的性别分化与乙烯密切相关,1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合酶是乙烯生物合成过程中的关键酶.根据ACC合酶基因家族的保守序列设计PCR引物,从8个不同性别类型(雌雄同株、强雌性和全雌性)黄瓜品种中克隆了长度为1188bp的ACC合酶基因(CS-ACS2)片段(GenBank登记号为:DQ115884～DQ115886和DQ115875～DQ115879).经测序分析,3个雌雄同株性别类型品种的序列完全相同.与之相比,5个强雌性和全雌性品种中存在8个单核苷酸多态性(SNPs)标记,SNPs标记为4个A←→G和4个T←→C之间的转换.在8个SNPs中,有1个SNP位于内含子区域,其余7个SNPs都位于外显子区域.在7个位于外显子区域的SNPs中,有3个为非编码区的SNPs,4个为cSNPs.而在4个cSNPs中,有3个导致了编码的氨基酸序列改变.研究结果表明,与雌雄同株性别类型相比,雌性系中均存在单核苷酸的变异,这提示ACC合酶基因CS-ACS2的单核苷酸变异可能与黄瓜雌性系的发生形成有关.另一方面,根据SNP多态性还发展了一个酶切扩增长度多态性(CAPS)标记C-MT700.利用CAPS标记C-MT700能将强雌性优良品种MT-705与其他黄瓜品种相区别,该标记在黄瓜育种生产上具有一定的应用价值.此外,研究获得的SNPs标记和CAPS标记丰富了黄瓜的分子标记种类.

番茄ACC_2合酶基因5’端前导序列的改造及特异表达分析

利用番茄LE—ACC25'-端2.0kb前导序列中第-1144位和第-166位的2个BglII位点,综合Rottmann和宋俊歧等对LE—ACC25'端2.0kb前导序列的功能区鉴定和分析结果,以删除、替代等方式构建了5种改造型的果实特异表达启动子,并进一步完成了6种(其中1种为全长序列)GUS基因植物表达载体的构建,用基因枪法和根癌农杆菌介导的叶盘共培养法转化番茄叶片、番茄和番木瓜成熟果实,通过GUS的组织化学分析和RNAdotblot分子杂交技术对转化结果作表达分析。结果表明,6种启动子均能启动GUS基因在果实中的表达,在番木瓜果实中的表达水平基本一致。

番茄LE-ACC_2合酶基因5′端前导序列分离方法的研究

通过ＰＣ／Ｇｅｎｅ软件对 Ｒｏｔｔｍａｎｎ等人发表的番茄 ＬＥ－ＡＣＣ２合酶的 ５’端 ２．０ Ｋｂ的前导序列作分析，设计了４对特异引物；以番茄果实、叶片的总ＤＮＡ为模板，采用特异ＰＣＲ扩增技术获得了 ２．０， １．８７， １．５８， １．２８ Ｋｂ ４个特异片段，用 Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ技术构建了１个克隆（２．０ Ｋｂ）、３个亚克隆（１．８７，１．５８，１．２８ Ｋｂ），对４个克隆产物进行了 ＤＮＡ序列测定，借助 ＰＣ／Ｇｅｎｅ软件对所获得的各克隆序列进行综合处理与分析，获得了番茄 ＬＥ－ＡＣＣ２ ５’端前导序列的同源率为９９．９％，但第－９７９位的 Ｃ和第－１０７６位的 Ｔ分别为 Ｔ和 Ｃ所替代。对利用 ＰＣＲ技术分离大片段ＤＮＡ的各环节作了较详细的研究。

砂梨ACC合酶cDNA全长克隆及其反义与正义表达载体构建

为构建干扰砂梨(Pyrus pyrifolia Nakai)ACC合酶基因表达的遗传转化载体,利用RACE技术从'早生新水'成熟果实cDNA中克隆了ACC合酶的cDNA,该cDNA全长为1939bp,命名为Pyp-ACS,GenBank登录号为EF566865。Pyp-ACS核苷酸序列含有5′末端非翻译区109bp、1488bp完整的开放阅读框和3′末端非翻译区342bp(含25bp的Ploy+(A))。Pyp-ACS编码495个氨基酸,与白梨(Pyrus×bretschneideri Rehd.)、西洋梨(Pyrus communisL.)、中国李(Prunus salicina Lindl.)、桃(Prunus persica(L.)Batsch)、梅(Prunus mume Seib.et Zucc.)、苹果(Malus×domestica Borkh.)和柿(Diospyros kaki Thunb.)有较高的同源性。该氨基酸序列具备ACC合酶7个保守区和组成该酶活性中心的12个氨基酸残基,即SLSKDMGFPGLR,进一步验证了克隆的正确性。以pYPX145载体为基础,分别将Pyp-ACS编码区序列反向和正向插入相应位点构建反义和正义表达载体,并分别命名为pPyp-ACS(-)和pPyp-ACS(+),目的基因由双35S启动子所控制。分别将这2个表达载体导入根癌农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens)EHA105,为耐贮藏转基因梨的遗传转化提供载体。

桃ACC合酶基因组DNA(pACSG01)的序列分析及其表达

以桃基因组DNA为模板 ,用套式PCR技术扩增并克隆了桃ACC合酶基因片段 ,将其克隆 (定名为pACSG0 1)并进行序列测定 ,表明该片段全长 132 0bp ,并富含HindⅢ和EcoRI位点 ,与其它ACC合酶基因结构序列有一定的相似性 ,内含两个内含子 ,编码的氨基酸序列与已克隆桃ACC合酶cDNA推导的氨基酸序列的同源性分别为 5 7.4%和5 6 .8%.pACSG0 1与我们已克隆的两个桃ACC合酶cDNA基因表达有所不同 ,RNA点杂交和RT -PCR结合Southern杂交分析表明 ,该基因在成熟和乙烯处理的果实均不表达 ,伤处理、LiCl和生长素处理也不能诱导该基因的表达 ,在衰老花瓣中也不表达 .图 3参

番茄ACC合酶(LeACS2)在大肠杆菌中的可溶性表达

植物激素乙烯参与了植物生长发育等一系列生理过程,通过控制乙烯的合成进而控制经济作物的衰老和果实的成熟,给农业带来深远影响。ACC合酶是高等植物乙烯生物合成的限速酶。通过RT_PCR将番茄ACC合酶(LeACS2)cDNA克隆至大肠杆菌表达载体pET30a中并使之与GST编码序列进行融合而构建了重组表达质粒pET_LeACS2_GST。转化获得含有该重组表达质粒的大肠杆菌BL21 starTM(DE3)pLysS细胞,在IPTG的诱导下成功表达出含有LeACS2的大小约83 000的融合蛋白。该融合蛋白具有较好的可溶性。通过GST亲和层析和MonoQ阴离子交换两步纯化后的LeACS2能够催化其底物SAM生成ACC。

RNA干扰技术抑制洋桔梗ACC合酶基因的表达

为了延长洋桔梗的花期,本研究通过农杆菌介导法,以ACC合酶(ACS)基因干扰表达载体,对Double Mariachi Pink洋桔梗(Eustoma grandiflorum)的叶片外植体进行了转化。经过再生芽的筛选增殖培养,在含有卡那霉素Km(15 mg/L)再生根筛选培养基中得到了46株抗性苗,其中11株经GFP基因PCR鉴定为阳性。经进一步的GFP基因RT-PCR鉴定,3株表达为阳性,并且其中2株经GFP荧光检测呈阳性。提取荧光阳性植株RNA,逆转录后,进行了ACS荧光定量PCR。结果表明,与未转基因对照植株相比,转基因植株ACS的相对表达量平均下降了63.17%。花期统计结果表明,ACS干扰表达载体转化的洋桔梗植株花期比未转基因植株对照延长了17 d。