玉米ACO基因家族生物信息学及表达模式分析

【目的】对玉米1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶ACO基因家族进行全基因组鉴定,分析其在玉米不同器官和不同发育时期以及响应外源激素和病菌侵染中的表达模式,为明确玉米ACO基因家族功能打下基础。【方法】利用生物信息学方法,在玉米B73自交系基因组中鉴定ACO,对其基因结构、蛋白质理化性质、家族成员间的亲缘关系以及保守基序进行分析,利用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)技术分析ZmACO基因家族的表达模式。【结果】除ZmACO11外,ZmACO家族成员均具有Fe2+离子结合位点和底物抗坏血酸结合位点。系统发育分析显示,ZmACO_(2)与ScACO在同一分支,亲缘关系较近,Bootstrap值达98。基因表达分析表明,ZmACO_(2)、5、9、15、20、35在各发育时期均活跃表达,且在叶片中呈优势表达,因此选择上述6个基因进行下一步检测。喷施乙烯利后,上述6个基因的表达均有所波动,其中ZmACO_(2)的表达量受影响较大,变化幅度在8倍左右。在乙烯利处理的0—24 h内这6个基因的表达量存在波动,但在处理后24 h,6个基因的表达量均接近0。水杨酸处理后,ZmACO5的表达量受影响较大,变化倍数在2倍左右。其他基因的表达量在处理后24 h均接近0。ZmACO9、35在3—12 h的表达量存在波动,ZmACO_(2)、15、20表达量呈下调趋势。在响应生物胁迫方面,接种玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)后,ZmACO5、9的表达量变化幅度最大,在接种后第10天,这两个基因的表达量分别升至对照组的50和60倍。接种玉米小斑病菌(Cochlibolus heterostrophus)后,ZmACO5的表达量变化幅度较大,变化倍数在40—90倍。接种立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)后,ZmACO5、35表达量变化幅度最大,在病菌接种的第3天达到200倍。【结论】ZmACO_(2)、5、20、35在玉米生长发育过程中表达变化最活跃;施加外源乙烯利和水杨酸可以对ZmACO的表达水平造成显著影响。病菌侵染玉米后ZmACO的表达水平产生显著变化,与生物胁迫应答关系密切。

根瘤农杆菌介导ACO基因转化延长石竹花期的研究

以石竹(Dianthus chinensis)叶片为外植体,通过根癌农杆菌介导的遗传转化体系,转ACO基因获得花期延长的石竹材料。结果表明:以MS为基本培养基,BA和NAA质量浓度分别为1.0、0.3 mg/L时,供试材料H58II、X82I和H68Ⅲ分化率较高,分别为56.9%、31.7%、93.2%;遗传转化筛选过程中,Kan、Hyg、Cef的最适筛选质量浓度分别为40、4和400mg/L;染色检测表明,转化成功的叶片或植株染色后呈现蓝色;PCR检测转ACO基因植株,阳性率达到89%。田间观察转ACO基因植株的瓶插花期和单朵花期可达到12d,比未转ACO基因植株的花期(6d)增加1倍;转ACO基因植株的盆栽群体花期可达到45d,比未转ACO基因植株的盆栽群体花期(30d左右)延长15d。

不同结构的外源ACO基因导入番茄对乙烯生成速率的影响

为研究不同结构的外源基因对内源基因的影响,通过农杆菌介导的遗传转化法将3种不同结构的外源ACO基因导入番茄基因组中,对3种不同载体转基因植株的乙烯生成情况进行了检测。结果表明,3种载体中,RNAi对内源ACO基因表达抑制作用最明显。

根癌农杆菌介导ACO基因对亚洲百合的转化

以亚洲百合‘普利安娜’的鳞块为基因转化的受体材料,利用根癌农杆菌介导法将ACO基因导入百合,研究了影响其转化的因素。结果表明,以鳞块为受体材料,外植体预培养0天的污染率最低,有利于农杆菌的侵染;菌液浓度OD600=0.8左右时侵染30min效果较好;重悬后菌液活化1～2h有利于抗性芽的分化;MS重悬液和共培养基中均添加20mg/L乙酰丁香酮(AS)可提高抗性芽分化率;去除大量元素中的NH4NO3可提高转化率;抗性植株经PCR检测部分呈现阳性,初步证明外源基因已整合到百合基因组中。

不同结构的外源ACO基因导入香石竹对瓶插寿命的影响

以香石竹叶片为外植体 ,利用根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)介导法 ,将香石竹ACC氧化酶 (ACO)基因核DNA的正义 (sense)、反义 (antisense)、正义重复 (sensedirectrepeat)和反义重复 (antisensedirectrepeat)等 4种T DNA结构导入香石竹‘Master’品种。经Southern杂交检测证明目的基因已整合到香石竹基因组 ,共获得 14个转化株系。在 2 5℃条件下比较瓶插寿命 ,对照植株花朵瓶插寿命为 5 8d ,多数转化株系花朵瓶插寿命达 11d ,最长者可达 12 8d。大多数转基因株系切花衰老过程中乙烯释放量显著减少 ,部分转基因株系切花衰老过程中几乎检测不到乙烯 ,而对照有明显的峰值。通过对本研究转化ACO基因核DNA与前人转化ACO基因cDNA延长瓶插寿命比较以及对不同T DNA结构的转化抑制内源基因表达的程度进行比较后 ,初步判断用核DNA转化后对内源基因的抑制效果与cDNA相当甚至更明显 ,反义基因可以比正义基因更有效地抑制内源的同源基因的表达 。

反义ACO基因导入获得瓶插寿命长的香石竹植株

通过农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)介导法 ,利用香石竹叶片作外植体 ,将反义香石竹ACC氧化酶基因导入香石竹‘黄星’品种 ,通过PCR扩增、Southernblot检测 ,证明反义ACC氧化酶基因已整合到香石竹基因组。研究发现 ,叶龄、乙酰丁香酮等对转化率有着较大影响。通过叶片的两度选择分化 ,大大减少了转化嵌合体比例。转基因植株在隔离条件下栽培 ,开花正常 ,切花在 2 5℃条件下瓶插寿命较对照延长了 4d。

玉米ACO家族的全基因组鉴定与表达分析

为培育玉米抗虫品种,采用生物信息学的方法对玉米ACO基因家族进行成员鉴定和分析。结果表明:玉米ACO基因家族成员有8个,等电点4.97~5.49。ACO基因分布在第2,4,5,7及10号染色体上。二级结构显示,该家族蛋白结构主要以α-螺旋、β-折叠和不规则卷曲为主。根据氨基酸序列相似性,玉米、拟南芥和水稻中的ACO蛋白可分为3个亚族:ACOⅠ~ACOⅢ,同族成员基因结构分布及氨基酸序列有很高的相似度。基因保守基序分布显示,ZmACOs蛋白均含有motif6-motif4-motif2-motif1-motif8分布的5段保守基序。基因启动子作用元件分析显示,玉米ACO基因启动子元件类型可分为激素应答元件和胁迫应答元件两大类。受粘虫取食后,除ZmACO2外,其它玉米ACO家族基因表达量均升高,其中ZmACO6和ZmACO7在取食前后表达量差异最明显,推测其参与了玉米的抗虫响应。

ACS和ACO基因克隆及植物转化

根据已知序列设计PCR引物，分别扩增氨基环丙烷羧酸合酶（ACS）和氨基环丙烷羧酸氧化酶（ACO）基因并克隆到中间载体，经限制性内切酶酶切图谱分析、部分序列分析以及Southern印迹鉴定后，将两个基因单个或相互串联后反向亚克隆至植物表达载体pBI121。经农杆菌LBA4404转化番茄子叶，在抗性培养基上得到8株ACS基因反义转化的生根小苗以ACS基因的酶切小片段作为探针，经Southern印迹分析，证明获得了两株阳性转化株。

芙蓉李PsACO1基因的克隆与生物信息学分析

采用RT-PCR和RACE技术从芙蓉李分离得到1条长度为1 309bp的PsACO1基因cDNA全长序列。该基因包含长度为957bp的开放阅读框,编码319个氨基酸。PsACO1蛋白的分子量为36.24kD,等电点为5.28,含有9个ACO特有的保守结构域。系统进化分析结果表明PsACO1与碧桃、梅、枇杷、苹果和欧洲李的ACO蛋白的亲缘关系较近。

外源ABA和乙烯利胁迫下斑茅ACO基因表达的实时PCR分析

研究了外源ABA和乙烯利胁迫处理对斑茅1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(ACO基因)表达情况的影响。在项目组克隆斑茅ACO基因的基础上,应用实时荧光PCR技术分析斑茅ACO基因在A-BA、乙烯利胁迫下的表达。结果表明,斑茅ACO基因在ABA的胁迫下,在3h有微弱上调表达,而6h时明显抑制,其后表达趋向平缓;在乙烯利的胁迫下,ACO基因在前期受抑制,其后呈明显上调表达,在24h后ACO基因的表达趋向平缓。斑茅ACO基因的表达受乙烯利诱导,而不受外源ABA诱导。

农杆菌介导的ACO基因RNAi载体转化百合抗衰老研究

本研究旨在通过根癌农杆菌介导法将ACO基因转入亚洲百合植株中,为植物抗衰老提供理论依据和技术基础。以亚洲百合‘精粹’无菌苗离体小鳞片为外植体,利用农杆菌介导法将携带有抗衰老基因ACO的RNAi载体转化到百合中,观测分析影响百合遗传转化的因素。结果表明:在遗传转化过程中,预培养3 d后,在菌液和共培养基中均添加25 mg/L乙酰丁香酮,将OD600=0.8的根癌农杆菌侵染小鳞片8 min,再共培养3 d,有利于获得最高遗传转化效率,抗性植株经PCR检测部分呈现阳性,初步证明ACO基因已经导入到百合基因组中。

桑树绿枝扦插生根过程中乙烯合成相关基因aco和sams的表达分析

植物内源乙烯对愈伤组织的诱导、增殖,不定芽、不定根的形成以及体细胞胚的诱导等过程都会产生重要的影响。利用荧光定量PCR技术检测诱导桑树绿枝插穗基部皮层生根过程中与乙烯合成相关的1-氨基-羧酸环丙烷氧化酶基因aco和S-腺苷-L-蛋氨酸合成酶基因sams的转录水平变化。结果表明插穗生根发育过程中aco和sams均表现为表达下调,其中生根率低的未诱导对照组插穗中这2个基因的转录水平均表现出先小幅下降后升高的变化特点,而生根率高的诱导组插穗中这2个基因则表现为持续低水平转录,尤其在插穗生根发育后期,2个基因在2个试验组插穗中的转录水平变化呈现近乎相反的变化特点。研究结果初步说明,乙烯合成相关基因aco和sams的mRNA转录水平与桑树绿枝插穗的生根率呈现负相关性。

7种植物花瓣ACO基因的克隆与分析

为获得通用的适用于植物花瓣ACO基因克隆与检测的引物,根据Genbank中收录的双子叶木本植物的ACO基因序列,设计1对简并引物,并用其对随机选择的7种植物(紫罗兰、多头菊、冬樱、迎春、云南杜鹃、垂丝海棠、山茶)的花瓣的RNA进行PCR扩增。结果发现:从7种植物花瓣中都能扩增出约800 bp的特异片段,登录Genbank发现均未被注册,将序列提交Genbank数据库,获得7种植物花瓣ACO基因的登录号(JX503067、JX503068、JX503069、JX503070、KC112390、KC112392、KC112393);在NCBI上进行blast比对,发现所克隆的7个ACO基因均与其他植物的ACO基因有一定的序列相似性,其中冬樱ACO基因与千叶桃花ACO基因同源性最高,为98%,迎春ACO基因与中华猕猴桃ACO6基因的同源性最低,为88%,将7个ACO基因的片段进行多序列比较分析,发现两两之间序列平均相似性为77%。

斑茅ACO基因(aco)的克隆及其在水分胁迫下的表达(英文)

利用RT-PCR技术,首次克隆了斑茅1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因序列.该片段长度为1123bp的片段,包括1个编码322个氨基酸的完整开放读码框,包括具有与异青霉素合成酶功能区类似的氧化功能PcbC区,和1个Fe2+和CO2活性中心。应用实时荧光PCR技术分析了1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因在聚乙二醇胁迫下4个时段的表达。结果表明,聚乙二醇胁迫2h时,该基因在叶片明显上调表达,4h后的表达趋向平缓。本研究为1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因进一步用于基因工程研究奠定基础,同时也初步揭示1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因的表达与水分胁迫相互关系,为探讨乙烯对水分胁迫响应的分子机制提供了初步依据。

龙眼果实ACS和ACO基因克隆及其表达特性

采用RT-PCR和RACE扩增技术相结合的方法从龙眼果实中分离得到ACS和ACO基因,并分别命名为DlACS1和DlACO1。DlACS1蛋白一共编码486个氨基酸,含有7个保守区域和11个不变的氨基残基;DlACO1蛋白一共编码315个氨基酸,含有7个保守区域和9个不变的氨基残基。在龙眼果实发育过程中,果实乙烯释放量在幼果期出现一个小峰,随后逐渐降低,至发育后期维持在较低水平。Northern分析表明,果皮中DlACS1和DlACO1的表达均在果实快速生长期达到最高;在果肉中,DlACS1只在果肉生长初期表达,DlACO1表达随着果肉的生长缓慢降低,在果实成熟期略有升高。此外,DlACS1和DlACO1表达不具有组织特异性,但在各组织中的表达有明显差异。上述结果为研究非跃变型果实的成熟与乙烯之间的关系奠定了基础。

苹果ACO1基因及转录因子MdHB-1基因的表达模式

研究苹果Md ACO1基因及转录因子Md HB-1基因在不同器官和不同发育阶段的表达量及其对外源乙烯的反应,以期探讨两基因之间的可能关系。以苹果品种'皇家嘎拉'为试材,利用实时荧光定量聚合酶链式反应技术分析不同器官和果实不同发育阶段基因的表达,以及乙烯利处理果实对基因表达的影响。在不同组织器官中,Md HB-1在花瓣中表达量较高,而Md ACO1在成熟果中表达量较高。在果实不同发育阶段中Md HB-1在未成熟果中(盛花期40 d后)表达量最高,Md ACO1在成熟果中尤其是花后100 d表达量最高。外源乙烯利(500?mg/L)处理的果实放置0~1 d时抑制Md HB-1的表达,但在7 d后其表达量增高;Md ACO1表达量在外源乙烯利处理后迅速升高,并随着放置时间的延长而大幅度增高。转录因子Md HB-1可能参与了苹果幼嫩果实和花器官中其他相关基因表达的调控,这一过程似与Md ACO1无关。Md ACO1参与了果实的成熟过程,但并无受Md HB-1调控的迹象。外源乙烯会诱导成熟果实ACO1基因的过量表达,这一反馈调节过程似与Md HB-1无关。

农杆菌介导的百合ACO反义基因遗传转化的研究

以东方百合‘索邦’(Liliumoriental‘Sorbonne’)无菌苗鳞茎、鳞片叶及愈伤组织为外植体,通过EHA105和GV3101两种根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株介导,将ACO反义基因导入东方百合"索邦"。结果表明,愈伤组织预培养7 d,侵染30 min,EHA105菌液浓度OD=0.8,共培养5 d,可获得7.14%的转化率。经GUS、PCR、PCR-Southern及基于梯状胶回收的PCR法检测证明ACO反义基因已转入转化植株基因组中。

旱柳、杞柳ACO基因家族的全基因组鉴定及表达分析

1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase,ACO)是植物中乙烯生物合成途径的限速酶。以ACO蛋白的保守结构域特征为基础,在旱柳(Salix matsudana)和杞柳(Salix integra)的全基因组测序结果中分别鉴定出42和33个ACO蛋白;并运用系列生物信息学方法分析其进化关系、基因结构、理化性质与表达模式等。结果表明:该家族成员可分为10个组,每组的保守基序特征与进化树基本一致。ACO基因含有3~6个外显子,编码238~438个氨基酸,蛋白质理论PI值在5.03~9.52之间,分子量为9.794~48.537 ku;染色体定位显示旱柳ACO基因分布在19条染色体上,部分基因串联重复形成基因簇。热图结果发现ACO基因家族成员在速生性强、弱品系中的表达水平具有差异性。

大蒜内参基因筛选及AsACO基因对盐胁迫和促生菌的响应分析

【目的】筛选大蒜在盐胁迫下的稳定内参基因,并分析1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(AsACO)对盐胁迫和促生菌的响应表达特性,为深入探究促生菌的促生机制及大蒜对盐胁迫的响应机制研究提供理论参考。【方法】以乐都紫皮大蒜为试材,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测5个内参基因ACT、UBC、HIS3、18S rRNA、TUB在盐胁迫下的表达稳定性,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper筛选出最稳定的内参基因,并分析恶臭假单胞菌UW4对盐胁迫下AsACO基因表达的影响。【结果】5个候选内参基因引物的特异性强、无引物二聚体。GeNorm分析得出候选内参基因稳定性排名为18S rRNA=TUB>HIS3>UBC>ACT,NormFinder分析得出内参基因稳定性排名为18S rRNA>HIS3>TUB>UBC>ACT,BestKeeper分析得出内参基因稳定性排名为UBC>HIS3>18S rRNA>TUB>ACT,最终以几何平均数综合分析得出18S rRNA为最稳定的内参基因。以18S rRNA为内参基因,检测出AsACO基因表达具有明显的组织特异性,在叶片中的相对表达量明显高于根。整个处理过程中,盐胁迫明显诱导AsACO基因在不同处理时间及不同组织中表达上调,根和叶片中AsACO基因的相对表达量分别在2 d和12 h时达最高,较正常培养(CK)分别显著升高124.43%和238.34%(P<0.05,下同),与盐胁迫处理相比,盐胁迫+浇施恶臭假单胞菌UW4处理显著降低AsACO基因在不同处理时间根和叶片中的相对表达量,其中在2 d和12 h时降幅较大,分别降低了112.08%和343.34%。【结论】18S rRNA是盐胁迫下大蒜中最稳定的内参基因。盐胁迫可诱导大蒜根和叶片中AsACO基因的上调表达,从而间接促进ACO和乙烯水平升高,加速由乙烯调控的细胞衰老,甚至死亡,但盐胁迫下恶臭假单胞UW4具有抑制AsACO基因表达的作用,以减少ACO和乙烯的合成,从而延缓大蒜细胞衰老,提高逆境耐受性。

鲜切花保鲜相关调控基因研究进展

对切花保鲜相关调控基因 :ACC氧化酶基因 (ACO) ,ACC合成酶基因 (ACS) ,etr- 1基因和切花保鲜相关调控因子 ;乙醇、乙醛。