肝癌细胞miR-326介导的ACRBP转录抑制的研究

目的:探究miR-326在人肝癌细胞株HepG2中对ACRBP表达的潜在调控作用。方法:运用TargetScan、miRanda和miRDB三个在线基因预测工具预测miR-326与ACRBP 3’UTR之间的保守结合位点;双荧光素酶报告系统分析ACRBP3’UTR保守结合位点突变后对miR-326与ACRBP结合能力的影响;通过慢病毒转染的方法获得稳定高表达miR-326的HepG2肝癌细胞株;利用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)和Western blotting检测miR-326上调对ACRBP mRNA和蛋白表达的影响。结果:在人肝癌细胞株HepG2中,miR-326可结合于ACRBP mRNA 3’UTR的保守位点,并抑制该基因mRNA翻译,从而抑制ACRBP的表达。结论:miR-326在HepG2中负向调控ACRBP的表达。

猪ACRBP基因真核表达载体的构建及生殖系统表达验证

本实验旨在获得带有增强型绿色荧光蛋白及表达猪ACRBP基因的pIRES2-EGFP-ACRBP真核表达载体和CHO细胞株,并且检测猪睾丸、附睾、前列腺、尿道球腺、精子、精清、性成熟母猪卵巢和输卵管中ACRBP蛋白的表达情况。本实验通过基因克隆的方法获得猪源ACRBP基因,并构建了pIRES2-EGFPACRBP真核表达载体,经过双酶切、测序鉴定后,转染CHO细胞,通过绿色荧光观察、RT-PCR和Westernblot检验ACRBP表达载体在CHO癌细胞株中的表达情况。结果显示:ACRBP蛋白在睾丸、附睾、前列腺、尿道球腺、卵巢、输卵管、精子中有条带,而在猪的精清中没有条带,转入CHO细胞后可观察到带荧光的阳性质粒,通过RT-PCR和Western-blot检测到ACRBP在CHO中得到了表达。

顶体素结合蛋白真核表达载体的构建及其在肝癌细胞株的表达

目的:构建ACRBP真核表达载体,建立稳定表达ACRBP的人肝癌细胞株,为后继研究该基因的功能奠定基础。方法:以pMAL-C2/ACRBP重组质粒作为模板进行PCR,扩增出ACRBP编码区cDNA,并与真核表达载体pEGFP-N1连接,构建pEGFP-N1/ACRBP重组质粒。通过Fugene HD将该重组质粒转染至ACRBP表达阴性的肝癌细胞株HepG2,经G418筛选阳性克隆获得稳定转染株。RT-PCR和免疫组织化学方法检测HepG2细胞中ACRBP的表达情况。结果:pEG-FP-N1/ACRBP真核表达载体经测序证实插入序列完全正确;ACRBP基因已经稳定转染至HepG2细胞中并获得表达。结论:成功构建了pEGFP-N1/ACRBP真核表达载体并将其转染HepG2后,能稳定地表达ACRBP。