野猪、家猪及其杂种猪ACSL4基因部分内含子的克隆和多态性分析

克隆猪ACSL4基因的内含子3和5,寻找其SNP位点。通过酚-氯仿法从野猪、家猪及其杂种猪的耳组织中提取基因组DNA。根据GenBank网站的猪ACSL4基因cDNA全序列设计两对引物进行PCR扩增,利用PCR-SSCP对获得的序列进行了多态性分析。对猪基因组进行PCR扩增,对获得的内含子3(232 bp)和内含子5(241 bp)序列进行克隆和测序,结果表明,基因片段分别是包含部分外显子3、4,完整的内含子3序列和部分外显子5、6,完整的内含子5序列,与人的该基因分别有72.87%和78.62%的同源性。多态性分析发现,该基因的两个内含子较为保守,未检测到多态位点。该研究为深入探讨该基因与肉质性状的关系以及丰富猪的种质资料库和分子育种提供了理论依据。

野猪·家猪及其杂种猪ACSL4基因3′UTR区多态性分析

[目的]为猪的分子育种研究提供理论依据。[方法]采用酚-氯仿法从野猪、民猪、大白猪、长白猪、杜洛克和杂种猪的耳组织中提取基因组DNA,根据GenBank上猪ACSL4基因cDNA全序列设计3对引物,进行PCR-SSCP和测序,分析ACSL4基因3UTR区的多态性。[结果]3对引物中,仅K3引物的PCR-SSCP产物有多态性,检测到3种基因型(AA、BB和AB)。在ACSL4基因3′UTR区3862 bp处发生T→C碱基突变。仅在大白猪、长白猪,杜洛克和杂种猪中发现多态性位点,而在民猪和野猪中未发现。杜洛克、大白猪和杂种猪间不同基因型的分布都有极显著差异(P<0.01),长白猪和大白猪各基因型的分布无显著差异(P>0.05)。[结论]该研究为丰富猪种的种质特性资料库和充分利用种质资源提供了依据。

人ACSL4基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究

目的构建带Flag标签的长链脂酰辅酶A合成酶4(acyl-CoA synthetase long chain family member 4,ACSL4)基因的真核表达载体,并对其表达产物Flag-ACSL4的生物学功能进行初步鉴定。方法通过PCR技术从人乳腺文库中扩增出ACSL4基因,并将其克隆到Flag载体中,经酶切和测序验证成功后,转染到乳腺癌ZR75-1细胞中,再通过Western印迹检测其表达情况,并通过细胞增殖检测、划痕、Transwell和铁死亡敏感性实验,测定细胞的增殖能力及ACSL4对乳腺癌细胞铁死亡的影响。结果从人乳腺文库中扩增得到大小为2136 bp的DNA片段,成功克隆到Flag载体上,经测序与目的序列完全一致,转染乳腺癌ZR75-1细胞后基因表达成功。细胞增殖实验表明,与空载体细胞相比,转染Flag-ACSL4的乳腺癌细胞增殖较快。划痕实验显示,转染Flag-ACSL4的乳腺癌ZR75-1细胞较空载体细胞迁移性增强。Transwell实验显示,转染Flag-ACSL4的乳腺癌ZR75-1细胞较空载体细胞侵袭能力增强。铁死亡敏感性实验表明,ACSL4可使铁死亡诱导剂RSL3(Ras-selective-lethal compound 3)诱导的细胞死亡敏感性显著增强。结论成功构建了带Flag标签的人ACSL4真核表达载体,为进一步研究ACSL4在脂肪酸代谢和在肿瘤发生发展中的功能打下良好的基础。