基因疫苗pcDNA-AChR_(α211)免疫小鼠建立重症肌无力动物模型

目的:用基因疫苗pcDNA-AChR_(α211)免疫C57BL/6小鼠建立实验性自身免疫性重症肌无力模型(EAMG)。方法:将人乙酰胆碱受体α亚基N端的主要免疫区(AChR_(α211))的基因片段插入到穿梭载体pcDNA3.0中,构建基因疫苗pcDNA-AChR_(α211)。大量提纯质粒pcDNA-AChR_(α211)后肌肉注射C57BL/6小鼠。用ELISA法检测小鼠血清中抗AChR_(α211)的IgG(ACh-RAb),并用PCR方法检测外源基因在小鼠各组织器官中的分布情况。结果:双酶切鉴定和序列测定表明构建了含正确目的基因阅读框的重组质粒pcDNA-AChR_(α211),ELISA分析表明该基因疫苗免疫的C57BL/6小鼠血清中含有AChRAb,且免疫三个月后在小鼠的肌肉、肝、脾、肾中仍可检测到目的基因AChR_(α211)的存在。结论:重组质粒pcDNA-AChR_(α211)作为基因疫苗能够诱导实验性自身免疫性重症肌无力。

AChR_(α211)的分泌表达及其对肌无力患者血清中AChRAb的清除作用

目的 在毕赤酵母(P .pastoris)中分泌表达AChRα2 1 1 ,研究其对重症肌无力患者血清中AChRAb的清除作用。方法 以质粒pUC AChRα2 1 1 为模板,PCR扩增人AChRα2 1 1 DNA片段,插入真核表达载体pPIC9K中。重组质粒转入P .pastorisGS115后,经甲醇诱导分泌表达AChRα2 1 1 ,用SepharoseQ离子交换柱和Superdex 75分子排阻层析进行纯化。Westernblot和ELISA进行免疫活性分析后,将目的蛋白偶联于CNBr Sepharose 4B树脂上,研究该免疫吸附剂对肌无力患者血清中AChRAb的清除作用。结果 双酶切鉴定和序列分析表明,AChRα2 1 1 DNA片段已正确插入到pPIC9K载体中。重组菌P .pastorisGS115 pPIC9K AChRα2 1 1 经甲醇诱导可分泌表达目的蛋白AChRα2 1 1 ,经阴离子交换柱和分子排阻层析可得95 %纯AChRα2 1 1 ,并制备成免疫吸附剂。Westernblot和ELISA分析表明,重组蛋白具有与天然AChRα亚基相似的免疫活性。免疫吸附实验表明该重组蛋白可特异性地去除肌无力患者血清中的AChRAb。结论 在P .pastoris中分泌表达并纯化重组蛋白AChRα2 1 1 ,制备成一种新的免疫吸附剂AChRα2 1 1 Sepharose ,可清除肌无力患者血清中的AChRAb。