AChR-α3亚基mRNA在人淋巴组织中的表达

①目的 探讨人淋巴组织中乙酰胆碱受体α3(AChR α3)亚基mRNA的表达及副交感神经系统对免疫系统作用的物质基础。②方法 应用地高辛尾段标记寡核苷酸探针原位杂交技术 (ISH) ,对 32例人淋巴组织冷冻切片中AChR α3亚基mRNA进行定性检测。③结果 32例人淋巴组织中有 1 9例AChR α3亚基mRNA表达阳性 ,阳性率为 5 9.38% ;淋巴结和脾脏AChR α3亚基mRNA阳性表达差异无统计学意义 (P =0 .2 6 8)。④结论人的免疫细胞可自身合成并表达AChR α3亚基 ;ACh通过与免疫活性细胞上的相应的AChR结合而参与免疫系统功能的调节。

人天然免疫蛋白载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A(APOBEC3A)的克隆表达及活性鉴定

目的构建载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A(APOBEC3A)表达载体,真核细胞表达APOBEC3A并鉴定其胞嘧啶脱氨酶活性。方法构建APOBEC3A真核表达载体pc DNA3.0-APOBEC3A,转染HEK293T细胞和Hep G2细胞。Western blot法鉴定APOBEC3A蛋白表达,免疫荧光细胞化学染色确定APOBEC3A在HEK293T细胞和Hep G2细胞的定位,利用组蛋白(His)标签蛋白纯化方法富集纯化APOBEC3A蛋白,荧光偏振技术检测APOBEC3A脱氨酶活性。结果 DNA测序证实pc DNA3.0-APOBEC3A插入长600 bp的APOBEC3A基因序列;该质粒能在HEK293T细胞和Hep G2细胞表达APOBEC3A,APOBEC3A在HEK293T细胞中主要分布于胞质,在Hep G2细胞中胞质和胞核均匀分布;纯化获得的APOBEC3A对单链DNA中TTCA序列具有胞嘧啶脱氨基活性。结论成功构建APOBEC3A真核表达载体,APOBEC3A在HEK293T细胞和Hep G2细胞定位不同,表达的APOBEC3A具有胞嘧啶脱氨基活性。

载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3B在血液肿瘤发生发展中作用的研究进展

血液肿瘤的发病率逐年上升,儿童白血病是儿童发病率最高的一种恶性肿瘤,多种基因变异与血液肿瘤的发生发展密切相关。载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3B(apolipoprotein B mRNA-editing catalytic polypeptide 3B,APOBEC3B)是胞嘧啶脱氨酶家族成员之一,可诱导靶DNA或RNA产生突变,是肿瘤基因组损伤的原因之一,在多种血液肿瘤中表达水平均较高。本文主要就APOBEC3B在血液肿瘤中作用的研究进展作一综述,以期为血液肿瘤靶向治疗及实现精准个性化治疗提供潜在靶点。

莲草直胸跳甲胰岛素样生长因子系统相关基因IGFALS和IMP3的表达模式

莲草直胸跳甲Agasicles hygrophila是恶性入侵杂草空心莲子草Alternanthera philoxeroides的专食性天敌。为阐明该跳甲生殖调控的分子机制,筛选其卵巢转录组数据得到3个胰岛素样生长因子系统相关基因,分别为胰岛素样生长因子酸不稳定亚基(IGFALS)和其亚型X1 (IGFALS X1)以及胰岛素样生长因子II mRNA结合蛋白3 (IMP3),利用半定量PCR方法检测3个基因在雌成虫不同发育时期的表达模式,并通过荧光定量PCR技术检测其在不同组织及不同发育时期的表达水平。结果显示,筛选到的IGFALS、IGFALS X1和IMP3基因在莲草直胸跳甲蛹期和成虫期均有表达,且3个基因在蛹期和成虫期均为全身性表达,IGFALS和IMP3 mRNA在成虫卵巢组织中表达量显著高于其他组织,峰值分别出现在成虫羽化后第5天和第1天,较蛹期第1天分别增加了3.56和3.81倍,因此推测IGFALS和IMP3基因在莲草直胸跳甲卵子发生过程中发挥重要的调控作用。

APOBEC3B调控葡萄膜黑色素瘤复制应激的研究

目的·研究载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3B(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 3B,APOBEC3B)在葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)中的生物学功能以及对药物治疗敏感性的影响。方法·应用免疫组织化学染色和Western blotting,分别检测眼部黑色素瘤[UM和结膜黑色素瘤(conjunctival melanoma,CM)]组织和细胞中APOBEC3B蛋白的表达水平。通过检索癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库,分析UM中APOBEC3B表达水平与预后的关联。使用CRISPR-Cas9质粒APOBEC3B-sgRNA敲除UM细胞系OMM2.3中APOBEC3B基因,构建APOBEC3B敲除的OMM2.3稳转细胞系sgAPOBEC3B以及对照细胞系Vector;并通过克隆形成实验,探索APOBEC3B敲除对OMM2.3细胞增殖的影响。同时,通过APOBEC3B-shRNA和空载质粒建立APOBEC3B敲低的OMM2.3细胞shAPOBEC3B和对照细胞shCtrl,对其进行转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq),检测差异基因,并通过基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)揭示APOBEC3B调控的下游通路。通过免疫荧光染色鉴定下游通路的关键蛋白。通过应用通路靶向药物处理,检测APOBEC3B对UM药物治疗敏感性的影响。结果·免疫组织化学染色结果表明眼部黑色素瘤(UM和CM)组织相较于良性色素痣组织APOBEC3B表达更高。Western blotting也表明包括OMM2.3细胞在内的大多数眼部黑色素瘤细胞相较于正常对照细胞(视网膜色素上皮细胞)APOBEC3B蛋白表达水平更高。并且TCGA数据库分析表明,APOBEC3B高表达的UM患者总生存期(P=0.032)和无病生存期(P=0.000)更短。然而APOBEC3B敲除并不影响OMM2.3细胞克隆形成的能力,APOBEC3B敲低也没有造成细胞周期的显著改变。shAPOBEC3B和shCtrl细胞系的RNA-seq差异基因富集分析结果显示,APOBEC3B参与调控OMM2.3细胞的复制应激相关通路,并且热图分析也显示APOBEC3B敲低后DNA复制应激相关通路基因表达发生改变。免疫荧光染色结果显示,APOBEC3B敲低后复制应激通路关键靶标磷酸化的复制蛋白A 32 kDa亚基(replication protein A 32 kDa subunit,RPA32)水平降低。在对APOBEC3B敲低的OMM2.3细胞和对照细胞的药物敏感性实验中,发现相较于shAPOBEC3B细胞,shCtrl细胞对细胞周期检测点激酶1(cell cycle checkpoint kinase 1,CHK1)抑制剂的敏感性更高。结论·APOBEC3B参与调控OMM2.3细胞复制应激相关通路,且APOBEC3B表达的OMM2.3细胞对CHK1抑制剂的处理更为敏感。

HIF-1α、β-连环蛋白、IMP3和PCNA在胃癌SGC-7901细胞增殖中的作用

目的:探讨缺氧环境下缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、β-连环蛋白(β-catenin)、胰岛素样生长因子ⅡmRNA结合蛋白3(insulin-like growth factorⅡmRNA-binding protein3,IMP3)和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在胃癌SGC-7901细胞增殖中的作用。方法:将pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-β-catenin质粒转染至SGC-7901细胞,建立稳定转染细胞株miR-β-catenin-7901。实验分成对照组(SGC-7901细胞在常氧条件下培养)、缺氧组(SGC-7901细胞在缺氧条件下培养)、干扰组(miR-β-catenin-7901细胞在常氧条件下培养)和缺氧干扰组(miR-β-catenin-7901细胞在缺氧条件下培养),采用平板克隆形成实验和细胞倍增时间检测各组SGC-7901细胞的增殖情况,蛋白质印迹法检测各组SGC-7901细胞中HIF-1α、β-连环蛋白、IMP3和PCNA蛋白的表达水平。结果:与对照组比较,缺氧组细胞的平板克隆形成数增多、倍增时间缩短(P<0.05);与缺氧组比较,缺氧干扰组细胞平板克隆形成数减少、倍增时间延长(P<0.05)。缺氧组细胞中HIF-1α、β-连环蛋白、IMP3和PCNA蛋白表达水平均高于对照组(P<0.05);干扰组细胞中HIF-1α、β-连环蛋白、IMP3和PCNA蛋白表达水平低于对照组(P<0.05);缺氧干扰组细胞中HIF-1α、β-连环蛋白、IMP3和PCNA蛋白表达水平低于缺氧组(P<0.05)。结论:胃癌细胞的增殖可能与HIF-1α和β-连环蛋白相互作用而上调IMP3和PCNA的表达水平有关。