AD5/F35腺病毒载体对不同来源造血系统恶性细胞转染效率的研究

本研究比较AD5/F35腺病毒载体对不同来源的血液系统恶性细胞系感染效率的差异和细胞毒性反应。用AD5/F35-EGFP以不同MOI(感染复数)感染不同来源的血液恶性细胞系并用AD5-EGFP作为对照;用流式细胞术检测荧光阳性细胞比例,进行荧光显微镜照相并用MTT法检测病毒对感染靶细胞的杀伤作用。结果表明:对于髓系来源的细胞在MOI为30时,AD5/F35载体的感染效率大于99%,AD5载体在MOI为1000时感染效率为26.4%;对于B系来源的细胞在MOI为1000时,AD5/F35载体感染效率为11.7%,AD5载体为5.7%;AD5/F35和AD5载体都不能有效地感染T系来源细胞,在MOI达到1000也未检测到荧光阳性细胞。在MOI为1000的情况下AD5/F35载体对感染靶细胞也无明显杀伤作用。结论:AD5/F35载体对不同来源的血液恶性细胞的感染具有一定的选择性,对髓系来源细胞感染能力强,对B系来源细胞有一定感染能力,而且对感染靶细胞毒性小。AD5/F35载体优于常用的5型腺病毒载体,在以髓系细胞为靶细胞的基因治疗中有着较好的应用前景。

嵌合性5型腺病毒载体Ad5/F35体外转染大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的:研究携带35型腺病毒纤毛的嵌合性5型腺病毒载体Ad5/F35能否有效地将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),并观察eGFP基因在大鼠BMSCs内持续表达的时间。方法:贴壁培养法分离、扩增大鼠BMSCs。用带有eGFP基因的Ad5/F35(Ad5/F35-eGFP)分别以1、10、100、1000的感染复数(MOI)转染第2代大鼠BMSCs;荧光倒置显微镜和流式细胞仪(FCM)检测eGFP基因的转染效率与表达水平,观察细胞生长状态以评估病毒对大鼠BMSCs基本生物学特性的影响;对MOI=100的病毒转染的大鼠BMSCs在转染后第2、7、14、21、30天分别用FCM检测大鼠BMSCs内eGFP的表达情况。结果:MOI在1到1000范围内,eGFP基因转染效率和表达水平与Ad5/F35-eGFP的MOI呈正向剂量相关性。MOI=100的病毒可转染90%左右的大鼠BMSCs,且eGFP基因在1个月内均有表达。MOI为1、10、100的病毒不影响大鼠BMSCs的活力和增殖能力。结论:Ad5/F35可以高效地将eGFP基因体外转染大鼠BMSCs,eGFP基因可持续表达1个月。本研究为Ad5/F35作为BMSCs的基因转移和表达载体进行细胞治疗与基因治疗提供了实验依据。

5和5/F35型腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞转染效率的比较

背景:在以人骨髓间充质干细胞为基础的基因治疗中,提高腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞的转染效率尤为重要。目的:对比观察5和5/F35型腺病毒载体对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率。设计、时间及地点:对比观察,于2008-03/10在解放军北京军区总医院血液科实验室完成。材料:骨髓来源于解放军北京军区总医院血液科异基因造血干细胞移植中健康供者,均无造血系统疾病。方法:采用密度梯度离心和贴壁筛选的方法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第3代后用流式细胞仪检测人骨髓间充质干细胞表型;按1×104/孔密度接种于24孔板,细胞贴壁后分别换用成骨、成脂诱导液培养,以碱性磷酸酶、油红O染色检测其分化特性。用不同滴度编码增强型绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad5/F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400感染复数转染体外培养的人骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下观察。主要观察指标:流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白阳性表达率,并用锥虫蓝拒染法检测不同病毒滴度感染后人骨髓间充质干细胞活细胞比例。结果:人骨髓间充质干细胞表面CD166、CD29、CD73、CD31、CD45、CD34和CD14阳性率分别为95.08%、99.53%、72.26%,1.50%,2.02%,3.80%和4.94%。人骨髓间充质干细胞成骨诱导后14d碱性磷酸酶染色为阳性,成脂诱导后14d油红O染色均为阳性。Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad5/F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400感染复数分别感染人骨髓间充质干细胞,2d后前者增强型绿色荧光蛋白阳性率分别为(0.72±0.14)%,(4.97±0.46)%,(9.80±3.43)%和(45.53±6.32)%;后者增强型绿色荧光蛋白阳性率分别为(24.31±10.55)%,(55.19±13.73)%,(87.68±9.5)%和(96.57±5.64)%。在5,20,100的感染复数,各组细胞存活率均在95%以上。在400的感染复数,细胞存活率明显降低,在90%以下。结论:Ad5/F35对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率明显优于Ad5载体。

Ad5F35嵌合腺病毒载体介导的突变性IκBα对白血病细胞凋亡的诱导作用

多种不同类型的白血病均存在持续活化的核转录因子κB(NF-κB),而抑制NF-κB活化诱导细胞凋亡有可能成为治疗白血病新的方法。本研究探讨修饰的5型腺病毒载体即Ad5F35嵌合腺病毒载体(Ad5F35 Vec)介导的突变性IκBα(IκBαDN)对白血病细胞凋亡的作用。将携带缺失5'端1-70个氨基酸编码序列的人IκBαAd5F35-IκBαDN Vec转染HL-60细胞。采用流式细胞术、DNA结合试验、实时定量PCR和Western blot技术分别检测细胞凋亡、NF-κB DNA结合活性、IκBα,cIAP-2和xIAP的表达。结果显示,转染48小时后,转染Ad5F35-IκBαDN Vec细胞、空白载体Ad5F35-EGFP Vec细胞以及未转染细胞的凋亡率分别为(22.53±2.999)%,(6.08±2.464)%和(4.86±1.366)%,其差异具有显著意义(Ad5F35-IκBαDN Vec vs未转染:p<0.001;Ad5F35-IκBαDNVec vs Ad5F35-EGFP Vec:p<0.001,p<0.002)。同时,NF-κB DNA结合活性降低,IκBα表达增加,但cIAP-2和xIAP mRNA的表达降低。结论:Ad5F35 Vec能够有效介导IκBαDN cDNA在HL-60细胞的表达,IκBαDN可抑制HL-60细胞NF-κB DNA结合活性并诱导其凋亡。

表达呼吸道合胞病毒融合前F蛋白的重组人5型腺病毒的构建

目的筛选并构建成功表达A亚型人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,HRSV)融合前构象F蛋白的重组人5型腺病毒(Recombinant Human type5 adenovirus,rHADV-5),为制备和研发HRSV重组腺病毒载体疫苗奠定基础。方法在真核表达载体pcDNA3.1(+)上插入具有不同突变位点的HRSV F蛋白编码序列,利用融合前F蛋白单克隆抗体AM14和D25筛选HRSV F蛋白突变体;通过同源重组将筛选出的前构象F蛋白突变体编码序列插入非复制型人5型腺病毒载体,在HEK293细胞中进行重组病毒的包装和扩增,经氯化铯密度梯度法获得纯化的重组病毒;应用夹心ELISA法和Western blot鉴定F蛋白的表达及构象。结果通过AM14和D25单克隆抗体筛选出了2个稳定维持在融和前构象的HRSV F蛋白序列(SC-3M和SC-5M)。将SC-3M和SC-5M编码序列插入非复制型人5型腺病毒载体,对两种重组人5型腺病毒(pAd5-SC-3M和pAd5-SC-5M)和空载体(pAd5-vector)纯化,病毒滴度分别达到2.016×10^(10),2.52×10^(10)和2.948×10^(11)IU/mL。pAd5-SC-3M和pAd5-SC-5M感染HEK293后均能高效表达HRSV融合前构象的F蛋白并维持三聚体结构,且pAd5-SC-5M感染细胞中F蛋白表达量高于pAd5-SC-3M。结论成功在体外传代细胞中获得可高效表达A型HRSV融合前F蛋白的重组人5型腺病毒,为进一步通过动物试验评价该HRSV重组腺病毒载体疫苗奠定了基础。

携带全长抗CD20抗体的嵌合型腺病毒Ad5F11b-Anti-CD20载体构建与表达研究

构建Ad5F11b-Anti-CD20嵌合型腺病毒载体并探索该腺病毒在体外表达全长抗体的能力。合成部核糖体进入位点(IRES)序列,将其与美罗华抗体重轻链连接,克隆到pDC338质粒载体上,并与以11b型腺病毒(Ad11b)Fiber替代5型腺病毒(Ad5)Fiber的嵌合型腺病毒骨架质粒pAd5F11b进行重组,获得Ad5F11b-Anti-CD20嵌合型腺病毒。将鉴定正确的病毒空斑感染293细胞,ELISA检测其表达水平以及间接免疫荧光检测该病毒表达抗体的特异性。结果表明,嵌合型腺病毒Ad5F11b-Anti-CD20在293细胞中的表达量高达3.78μg/ml±0.30μg/ml,间接免疫荧光(IFA)显示该病毒表达的抗体只与CD20+的Raji细胞有特异性结合,而与CD20-的Molt-4细胞无结合能力。成功构建了高效表达抗CD20抗体的嵌合型腺病毒Ad5F11b-Anti-CD20。

重组腺病毒Ad5F35-IL-12感染不同单核-巨噬细胞的研究

目的确定人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12在不同人单核-巨噬细胞中的表达。方法将人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12分别感染人外周血单个核细胞、胸水巨噬细胞,以及THP-1和U937单核细胞株及其经佛波酯(PMA)诱导后生成的巨噬细胞;感染48 h后荧光显微镜观察对相应细胞的感染效率,RT-PCR检测IL-12双亚基p35和p40的mRNA表达情况,ELISA检测细胞培养上清中IL-12p70的分泌水平。结果人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12可成功感染人外周血单个核细胞、胸水巨噬细胞以及THP-1和U937单核细胞株及其PMA诱导后生成的巨噬细胞,并分泌IL-12 p70蛋白,蛋白表达量从高至低依次是胸水巨噬细胞、PMA诱导后U937细胞、PMA诱导后THP-1细胞、U937细胞、外周血单个核细胞、THP-1细胞。结论人IL-12基因重组腺病毒Ad5F35-IL-12可以感染不同的单核-巨噬细胞,并成功表达分泌IL-12 p70蛋白。

人Wilms瘤基因1重组腺病毒Ad5/F35的制备及感染树突状细胞后的鉴定

目的构建人Wilms瘤基因1(WT1)重组腺病毒载体Ad5/F35并鉴定。方法运用不同病毒滴度的Ad5-EGFP和Ad5/F35-EGFP感染黑素瘤患者外周血树突状细胞(DC),用荧光显微镜检测EGFP的表达,选择对DC感染率高的腺病毒;同源重组构建Ad5/F35-WT1腺病毒载体,用免疫细胞化学和流式细胞术(FCM)检测WT1的表达。结果在相同滴度下,腺病毒载体Ad5/F35的感染优于Ad5;成功构建了Ad5/F35-WT1重组腺病毒,免疫细胞化学染色和FCM证实该病毒能有效介导WT1在DC中的表达。结论 Ad5/F35-WT1重组腺病毒能将WT1基因成功导入DC并有效表达。

高感染力嵌合型腺病毒载体的构建及其感染力的流式细胞术测定

目的构建1种35型腺病毒(Ad35)Fiber替代5型腺病毒(Ad5)Fiber的嵌合型腺病毒载体,探索该腺病毒载体感染肿瘤细胞的效率。方法PCR扩增Ad35腺病毒Fiber序列,插入并置换Ad5的Fiber序列,构建Ad5-F35嵌合型腺病毒载体,使之携带绿色荧光蛋白报告基因EGFP;以MOI=5的Ad5-F35EGFP病毒感染度感染淋巴瘤细胞raji和胃癌细胞SGC-7901,流式细胞术检测EGFP表达,借以判断病毒感染细胞的能力。结果成功构建携带EGFP的嵌合型腺病毒载体pAd5-F35EGFP,并在293细胞中重组出Ad5-F35EGFP嵌合型腺病毒,扩增纯化后病毒滴度达到3.4×109pfu/ml;流式细胞仪检测发现,Ad5-F35EGFP在淋巴瘤细胞raji和胃癌细胞SGC-7901内表达EGFP的强度明显比传统的Ad5-EGFP提高。结论Ad5-F35嵌合型腺病毒感染肿瘤细胞的能力明显增强,为提高腺病毒载体转染抗肿瘤基因的效率、改进肿瘤基因治疗的临床疗效奠定了基础。

共表达CD40L和IL-2的腺病毒对树突状细胞成熟和IL-12产生的影响

目的探讨共表达人CD40L和IL-2的5/F35嵌合型腺病毒载体(Ad5/F35 CD40L-IL-2),对人单核细胞来源的树突状细胞(Mo-DC)的感染效率及感染后对Mo-DC表型及IL-12产生的影响。方法提取人外周血单个核细胞(PBMCs)总RNA,应用RT-PCR方法克隆CD40L和IL-2,构建Ad5/F35 CD40L-IL-2腺病毒载体。分离和培养人Mo-DC后,应用流式细胞仪分析嵌合型腺病毒载体对Mo-DC的感染效率、CD40L基因表达及感染前后Mo-DC表型的变化;采用ELISA法测定Mo-DC培养上清中细胞因子IL-2和IL-12的含量。结果成功克隆CD40L和IL-2基因并构建成5/F35嵌合型腺病毒载体。Ad5/F35嵌合型腺病毒载体能高效感染Mo-DC,感染效率可达75%以上,Ad5/F35 CD40L-IL-2感染Mo-DC能有效地表达CD40L和分泌IL-2。感染前Mo-DC中CD80、CD86、CD40和HLA-DR呈一定水平表达,而CD83表达水平较低,感染24 h后,CD80、CD86、CD40和HLA-DR表达水平明显上调,特别是CD83。感染不同时间点测定Mo-DC上清IL-12水平,上清中IL-12水平升高呈时间依赖性。结论 Ad5/F35 CD40L-IL-2能高效感染人Mo-DC并表达相应的基因产物,促进Mo-DC成熟和刺激IL-12的分泌。

Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及Lipofectamine^(TM) 2000对4种细胞转染效率的比较

目的将腺病毒Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000对4种细胞的转染效率进行比较,以获得Ad5F35-GFP适用的细胞种类及各类细胞适用的转染方法。方法采用携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因的Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000,分别转染人慢性粒细胞白血病细胞K562、人外周血单个核细胞(PBMC)、小鼠脂肪细胞3T3-L1和肝癌细胞Hep A1-6,于转染48 h后,倒置荧光显微镜下观察转染效率,RT-PCR法检测GFP基因mRNA的转录水平。结果 Ad5F35-GFP转染K562细胞、PBMC效率均较高,分别为61%和56%,但不能有效地转染3T3-L1(5%)、HepA1-6(15%)细胞;Ad5F35-GFP、Ad5-GFP及LipofectamineTM2000均不能有效地转染3T3-L1细胞,转染效率分别为5%、5%和6%;Ad5-GFP、LipofectamineTM2000转染Hep A1-6细胞效率均较高,分别为73%和71%。结论 Ad5F35-GFP可有效转染人造血细胞和单核细胞,为相关基因的研究及治疗领域的应用奠定了基础。

APE1在PDT治疗非小细胞肺癌中的表达变化及疗效的关系

目的探讨光动力疗法(PDT)治疗非小细胞肺癌对脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)表达的影响及疗效的关系。方法以Western blot分析PDT处理调控作用影响A549细胞APE1表达变化的时效关系,构建Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒干扰载体,通过Western blot检测其对APE1蛋白的敲低作用,设空白对照组、Ad5/F35-APE1 siRNA感染组、PDT组和Ad5/F35-APE1 siRNA+PDT组,采用MTT法观察不同组对A549细胞的增殖抑制作用。结果PDT诱导A549细胞APE1蛋白表达增强在24h达到高峰,10MOI Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒感染A549细胞48h抑制APE1表达最为显著,MTT检测显示随光照剂量的增加增殖抑制作用显著增强,同时Ad5/F35-APE1 siRNA+PDT组对A549细胞具有明显的增殖抑制作用。结论Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒能有效抑制PDT诱导的肺癌细胞APE1表达增加,明显增强PDT对肺癌细胞的杀伤效应。