肿瘤相关基因ADAM15在结肠癌中一个非同义变异对细胞黏附及侵袭的影响

目的解析ADAM15基因单核苷酸变异(single nucleotide variant,SNV)在结肠癌肿瘤发生发展相关的细胞学过程中的具体功能作用。方法首先对具有侵袭表型的结肠癌患者癌组织及癌旁组织全外显子组测序,然后进行野生型/突变型ADAM15结肠癌HCT-8细胞系细胞功能实验,进而完成野生型/突变型ADAM15细胞系的转录组测序分析。结果采用全外显子组测序在预后不良的患者中检出ADAM15基因SNV rs6427128,提示可能影响结肠癌的进展。细胞功能实验显示,rs6427128损失了ADAM15所具有的上调细胞侵袭能力的作用,而使细胞黏附能力增加约26%。转录组测序分析显示,与野生型相比,rs6427128过表达细胞的差异表达基因富集在细胞黏附、DNA的复制与转录、炎症反应等多种细胞生物学过程,提示rs6427128变异可能通过促进肿瘤细胞的黏附参与调节肿瘤微环境的重塑,从而影响结肠癌的进展。结论结合适当的细胞模型和较为精细的分析方法,深入解析临床样本中所检出的一些高频非同义潜在功能性变异体,可以为肿瘤相关基因的结构功能关系提供有益的提示性实验室数据。

ADAM15与MMP-2、MMP-9 mRNA在乳腺癌组织中的表达及意义

目的:探讨ADAM15、MMP-2、MMP-9 mRNA在乳腺癌组织中的表达、与临床病理特征的关系及对乳腺癌转移、预后的影响。方法:采用原位杂交技术检测45例乳腺癌和20例乳腺良性病变中ADAM15、MMP-2和MMP-9 mRNA表达情况。分析ADAM15 mRNA表达与乳腺癌临床病理特征的关系并分析ADAM15 mRNA与MMP-2、MMP-9 mRNA表达的相关性。从TCGA数据库获取乳腺癌转录组数据,通过生物信息学分析相关因素与乳腺癌临床病理特征的关系。结果:ADAM15 mRNA在乳腺癌中高表达,并与乳腺癌淋巴结转移和临床分期密切相关,与患者年龄和肿瘤大小无关。乳腺癌中MMP-2和MMP-9 mRNA阳性率均明显升高,且均与淋巴结转移相关。乳腺癌组织中ADAM15和MMP-2、MMP-9的mRNA表达均呈正相关。生物信息学分析表明ADAM15 mRNA在乳腺癌组织中高表达,其高表达与患者预后密切相关。结论:ADAM15 mRNA在乳腺癌中高表达,与淋巴结转移呈正相关并与患者预后呈负相关,ADAM15 mRNA有可能通过上调MMP-2和MMP-9 mRNA的表达而促进乳腺癌转移。

改善稀有密码子和氨基酸残基限制提高重组人ADAM15去整合素结构域蛋白表达水平

【目的】为提高重组人ADAM(A Disintegrin And Metalloproteinase)15去整合素结构域蛋白(rhADAM15)的表达水平。【方法】在详尽分析rhADAM15的cDNA和GST(谷胱甘肽-S-转移酶)-ADAM15结构的基础上,选择表达宿主菌并对表达质粒进行改造。【结果】(1)选择能为大肠杆菌稀有密码子提供额外tRNA的Escherichia coli.Rosetta(DE3)作为宿主菌,将质粒pGEX-ADAM15转化于其中在最佳诱导表达条件下获得298mg/L融合蛋白GST-ADAM15;(2)采用PCR体外定点突变技术将目标蛋白编码区稀有密码子GGA(Gly425)替换为GGC,使融合蛋白表达水平提高9.4%;(3)通过消除凝血酶识别序列附近的Pro-Glu-Phe残基,提高凝血酶酶切效率,使rhADAM15产量提高了35.7%;(4)在GGA替换为GGC基础上切除"Pro-Glu-Phe"残基,使rhADAM15产量提高到68mg/L,比分别切除"Pro-Glu-Phe"残基、GGA替换为GGC和野生型提高了19.2%、51.1%和61.9%。【结论】这一结果表明,在充分认识目标蛋白特性的基础上定向选择表达宿主并改造表达质粒能实现外源蛋白高水平表达。

ADAM15通过激活EGFR促进结直肠癌细胞的转移侵袭

目的探讨结直肠癌细胞中ADAM15的表达及其对结直肠癌细胞迁移侵袭能力的影响。方法 Western blotting检测人正常结直肠黏膜细胞系FHC和人结直肠癌细胞系Caco-2、SW-480、DKO-1中ADAM15蛋白的表达。向SW-480细胞分别转染si NC(si NC组)和si ADAM15(si ADAM15组),细胞划痕实验和Transwell实验检测两组SW-480细胞迁移、侵袭能力; Western blotting检测si NC组、si ADAM15组和FHC细胞系中p-EGFR、EGFR、ADAM15蛋白的表达。结果 Caco-2、SW-480及DKO-1细胞系中ADAM15表达量分别为2. 01±0. 149、2. 74±0. 053、2. 27±0. 185,均高于FHC细胞系的0. 98±0. 043,差异有统计学意义(P<0. 05)。划痕实验显示,si ADAM15组24 h划痕宽度与0 h划痕宽度比值为0. 925±0. 087,明显高于si NC组的0. 326±0. 031,差异有统计学意义(P<0. 05)。Transwell实验显示,si ADAM15组SW-480细胞侵袭数目为327. 4±42. 13,显著低于si NC组的669. 7±35. 21,差异有统计学意义(P<0. 05)。si NC组SW-480细胞中p-EGFR表达量为0. 89±0. 097,显著高于FHC细胞系的0. 42±0. 035,差异有统计学意义(P<0. 05); si ADAM15组SW-480细胞中p-EGFR表达量为0. 27±0. 067,显著低于si NC组的0. 89±0. 097,差异有统计学意义(P<0. 05)。结论 ADAM15可能通过激活EGFR促进结直肠癌细胞的迁移侵袭过程。

ADAM15、MMP-2和MMP-9在不同转移能力乳腺癌细胞系中的表达差异

目的分析ADAM15、MMP-2和MMP-9在不同转移能力乳腺癌细胞系中的表达,探讨其与乳腺癌细胞转移的相关性。方法 Transwell小室实验检测两种乳腺癌细胞系的转移能力,免疫细胞化学法对ADAM15、MMP-2及MMP-9在两种细胞中的表达进行定性、定位及半定量检测,Western blot对其进行定量检测。结果 MDA-MB-231乳腺癌细胞系的运动和侵袭能力均强于MCF-7乳腺癌细胞系。ADAM15、MMP-2及MMP-9在MDA-MB-231细胞系中的表达分别高于MCF-7细胞系(免疫细胞化学:P<0.001,P<0.05,P<0.001;Western blot:P<0.01,P<0.05,P<0.01),且三者在两系乳腺癌细胞表达的差异中,ADAM15表达的差异性最大,其次为MMP-9,MMP-2的差异性最小。结论 ADAM15、MMP-2及MMP-9均促进乳腺癌转移,且ADAM15与转移相关性最强而可能成为判断乳腺癌恶性生物学行为的指标。

ADAM15在舌癌耐药细胞系Tca8113/ADM表达的实验研究

目的研究舌癌阿霉素(adriamycin,ADM)耐药细胞系Tca8113/ADM及其亲本细胞系Tca8113肿瘤转移相关蛋白去整合素-金属蛋白酶15(adamalysin15,ADAM15)的表达水平,从肿瘤耐药的角度对舌癌的耐药与ADAM15的关系进行初步探讨。方法用蛋白免疫印迹技术检测Tca8113/ADM及Tca8113亲本细胞系的ADAM15蛋白表达水平。结果 ADAM15在Tca8113亲本细胞系和Tca8113/ADM细胞系的表达分别为0.244±0.231和1.217±0.494,两者差异具有统计学意义(P=0.001)。结论肿瘤转移相关蛋白ADAM15在Tca8113/ADM细胞系的表达高于其在亲本细胞的表达,提示舌癌的阿霉素耐药细胞系的转移性可能比其亲本细胞更强。

重组人ADAM15去整合素区域蛋白抑制HeLa细胞的增殖及迁移

观察重组人ADAM15去整合素区域蛋白(记做rhdd ADAM15)干预He La细胞在体内外的增殖及迁移效应,初步鉴定了其作用的相关通路,为研究其作用机制提供基础。利用SRB法及划痕法测得rhdd ADAM15对He La体外的增殖及迁移均有明显的抑制作用,IC50分别为2.44、1.60μmol/L,当其浓度低于8μmol/L时,细胞增殖及迁移抑制率与蛋白质浓度呈剂量依赖关系;利用瞬时转染法在He La细胞内过表达rhdd ADAM15,致使He La细胞的迁移能力下降,细胞周期出现S期阻滞,阻滞率约为5%;SRB法表明,MAPK通路激动剂EGF可以逆转rhdd ADAM抑制He La细胞增殖的效应;利用斑马鱼肿瘤移植模型,观察得到rhdd ADAM15对斑马鱼体内He La细胞生长及转移均有明显的抑制作用。以上结果表明,rhdd ADAM15可抑制He La细胞体内外的增殖及迁移,这种抑制作用与MAPK信号通路密切相关,作用靶点在细胞外及细胞内均有分布。

ADAM15在支气管哮喘表达及意义

目的:研究整合素金属蛋白酶15(a disintegrin and metalloproteinase 15,ADAM15)在支气管哮喘中表达及可能机制。方法:收集本院32例哮喘患者及同期16例健康对照的临床资料及血清标本,酶联免疫吸附法检测血清ADAM15水平,分析其与外周血嗜酸性粒细胞数、血清总IgE相关性。构建OVA诱导的过敏性哮喘小鼠模型,免疫组化观察小鼠肺组织ADAM15表达部位和变化。不同细胞因子刺激人支气管上皮细胞系(16HBE),分别用实时定量PCR法和蛋白质免疫印迹法检测细胞ADAM15 mRNA和蛋白表达。结果:与对照组[(398.90±22.13)pg/mL]相比,哮喘患者血清ADAM15水平明显增高[(749.5±132.3)pg/mL,P=0.023],与血清总IgE水平呈正相关(P=0.0016,r=0.5425)。ADAM15主要表达于过敏性哮喘小鼠肺组织支气管上皮细胞,其表达量较对照组小鼠升高。IL-13可上调支气管上皮细胞ADAM15 mRNA及蛋白水平。结论:哮喘中ADAM15表达增加,可能与IL-13介导的哮喘气道炎症有关。

ADAM-15在WHOⅠ级脑膜瘤中的表达及其与侵袭性的相关研究

目的:探究ADAM-15在WHOⅠ级脑膜瘤中的表达情况,进一步分析其在WHOⅠ级脑膜瘤侵袭性生长中的意义。方法:收集63例WHOⅠ级脑膜瘤标本(33例有侵袭性,30例无侵袭性)为试验组,21例正常脑膜组织为对照组。通过免疫组织化SP法检测去整合素-金属蛋白酶15(A Disintegrin and Metalloproteinase 15,ADAM-15)在上述不同脑膜组织中的表达情况。结果:试验组ADAM-15的阳性表达率高于对照组,差异有统计学意义(x^2=17.296,P<0.001)。侵袭性组ADAM-15的阳性表达率高于非侵袭性组,差异有统计学意义(x^2=8.376,P=0.004)。侵袭性组ADAM-15的阳性表达率高于对照组,差异有统计学意义(x^2=24.661,P<0.001)。非侵袭性组ADAM-15的阳性表达率高于对照组,差异有统计学意义(x^2=6.801,P=0.009)。结论:ADAM-15在WHOⅠ级脑膜瘤侵袭性生长中起一定作用。

去整合素金属蛋白酶15通过AKT/ERK通路和MMP9影响肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的探讨去整合素金属蛋白酶15(ADAM15)对肺癌细胞系H460细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法收集20对非小细胞肺癌和癌旁组织标本,用RT-PCR检测各组织中ADAM15的mRNA表达水平(P<0.05)。通过Western blot测定ADAM15在正常支气管上皮细胞BEAS-2B以及肺癌细胞株(A549、H1299、SPC、H460)中的表达,以及AKT/ERK信号途径相关蛋白的表达水平。通过CCK-8法分析细胞增殖的活力(P<0.001)。通过划痕实验和transwell实验评估细胞的迁移和侵袭能力(P<0.001)。结果ADAM15在非小细胞肺癌中高表达,并与预后有关;沉默ADAM15后H460细胞的增殖,迁移和侵袭能力明显下降,伴随着磷酸化AKT,磷酸化ERK和基质金属蛋白酶9(MMP9)的下调(P<0.001)。结论沉默ADAM15可抑制NSCLC的增殖、迁移和侵袭,其作用机制可能与抑制AKT/ERK通路和MMP9有关。

ADAMs在中国汉族肺癌人群中的表达模式分析

目的探讨去整合素基质金属蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease,ADAMs)家族成员在中国汉族人群肺癌中的表达模式。方法应用免疫组化、real-time PCR和western blotting检测ADAM-12、-15和-17在20例肺腺癌、20例肺鳞癌、10例小细胞肺癌标本以及不同病理类型肺癌细胞株中的表达。结果 ADAM-12在肺腺癌、鳞癌以及小细胞肺癌中的阳性表达率分别为25%、20%和50%;ADAM-15在肺腺癌、鳞癌和小细胞肺癌中的阳性表达率分别为70%、20%和10%;ADAM-17在肺腺癌、鳞癌和小细胞肺癌中的阳性表达率分别为35%/、45%和10%;它们在细胞株中的表达与组织样品相一致。结论 ADAMs家族成员在不同病理类型肺癌中的表达有较大差异,提示ADAMs家族成员在不同病理类型肺癌的发生、发展、浸润转移中的作用不一致。该研究为肺癌浸润转移机制的研究提供实验依据。

抗人ADAMl5抗体与胃癌、肺癌及血管内皮细胞结合的实验研究

目的研究抗人去整合素金属蛋白酶15（adisintegrinandmetalloproteinase15，ADAMl5）多克隆抗体（anti．ADAMl5抗体）与胃癌、肺癌和血管内皮细胞结合的特性。方法制备并纯化anti．ADAMl5抗体，用间接ELISA法检测不同时间、不同抗体滴度的情况下，肺癌A549细胞、胃癌HGC-27细胞及血管内皮HMEC．1细胞与抗体结合后的光密度值。结果抗体浓度为2-8pg／mL的条件下，anti-ADAMl5抗体与三种细胞株的结合程度随抗体浓度的增高而增高；孵育时间为24h或48h的结合程度明显高于2h。结论anti-ADAMl5抗体能与胃癌细胞、肺癌细胞和血管内皮细胞结合，有望用于恶性肿瘤的诊治。

ADAM15在肝内胆管癌的临床意义及可能作用机制

目的探讨去整合素-金属蛋白酶15(ADAM15)在肝内胆管癌(ICC)中的表达及其对ICC细胞增殖和迁移能力的影响。方法将加入si-NC-RNA的ICC细胞为对照组、加入si-ADAM15-RNA的ICC细胞为实验组。使用PanCanSurvPlot和Kaplan-Meier plotter分别分析ADAM15在ICC中的表达和其与ICC预后的关系。使用基因富集分析(GSEA)对癌症基因组图谱(TCGA)CHOL数据库中与ADAM15相关的差异表达基因进行KEGG分析。RT-qPCR检测ICC细胞中ADAM15 mRNA的表达。采用siRNA技术沉默ICC细胞中的ADAM15基因,CCK-8实验检测ICC细胞的增殖能力,划痕实验和Transwell实验检测ICC细胞的迁移能力。通过免疫印迹试验探究ADAM15敲低后对细胞周期和迁移相关蛋白的影响。流式细胞术分析ADAM15敲低后对细胞周期的影响。结果ADAM15在ICC组织及ICC细胞中均呈高表达(t>13.14,P<0.05)。ADAM15高表达ICC患者预后较ADAM15低表达患者差,差异有统计学意义(P=5.14e-02,P<0.01)。与si-NC组比较,沉默ADAM15能显著抑制ICC细胞的增殖和迁移能力,差异均有统计学意义(P均<0.05)。与si-NC组相比,沉默ADAM15能明显抑制ICC细胞中的上皮间质转化和细胞周期相关蛋白的表达,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论ADAM15在ICC中高表达,且与ICC患者不良预后相关。沉默ADAM15可抑制ICC细胞增殖、迁移以及EMT通路活性。

解聚素金属蛋白酶在自身免疫性关节炎中的表达及与疾病活动的相关性研究

目的:探讨解聚素金属蛋白酶家族是否参与了自身免疫性关节炎的发病过程。方法:检测自身免疫性关节炎患者外周血单个核细胞中解聚素金属蛋白酶的表达,与疾病的炎症活动指标及标志性抗体进行相关分析,关节炎类型包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮关节炎和其他结缔组织病关节炎。结果:与健康对照者相比,解聚素金属蛋白酶在类风湿关节炎、系统性红斑狼疮关节炎和其他结缔组织病关节炎中均升高,疾病的活动性指标具有相关性。结论:解聚素金属蛋白酶家族参与了自身免疫性关节炎的发病。

^(125)I标记抗人ADAM151多克隆抗体在荷胃癌裸鼠体内的生物分布和放射免疫显像

目的研究125I标记抗人ADAM15多克隆抗体(125I-anti-ADAM15抗体)在荷人胃癌裸鼠体内的生物分布。方法以氯胺T法制备125I-anti-ADAM15抗体并测定其在生理盐水和人血清中的稳定性。经荷胃癌裸鼠模型尾静脉注入125I-anti-ADAM15抗体后1、4、8、24和48 h对裸鼠进行SPECT平面显像,采用感兴趣区(ROI)技术进行半定量分析,计算肿瘤与非瘤组织的放射性计数比值(T/NT)和肿瘤与裸鼠全身的放射性计数比值。于48 h显像后处死荷瘤裸鼠,取心、肺、甲状腺和肿瘤等多个脏器组织称重并测量其放射性计数,计算各组织的每克组织百分注射剂量率(%ID/g)。结果125I-anti-ADAM15抗体标记率为(75.16±9.43)%,纯化后放射化学纯度可达(99.44±0.21)%。经尾静脉注入125I-anti-ADAM15抗体后,随时间的延长,T/NT逐渐增高。在48 h时肿瘤清晰显影,T/NT可达3.84±0.43。结论125I-anti-ADAM15抗体在荷胃癌裸鼠体内具有肿瘤靶向定位能力,能获得良好的放射免疫显像图像。

重组人ADAM15去整合素区域蛋白与人血清白蛋白融合蛋白的表达及其活性

目的在毕赤酵母中表达重组人ADAM15去整合素区域蛋白(recombinant human disintegrin of ADAM15,rhddADAM15)与人血清白蛋白融合蛋白(HSA-rhddADAM15-His),并测定其活性。方法以rhddADAM15基因为模板,PCR扩增rhddADAM15-His基因,克隆入pBluescript-HSA质粒中,经酶切后与pPIC9k载体连接,构建重组表达质粒pPIC9k-HSA-rhddADAM15-His,将重组表达质粒转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。表达产物经Blue-Sepharose、Ni2+螯合层析及DEAE阴离子交换层析纯化,纯化产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,利用划痕及SRB法检测其活性。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;融合蛋白HSA-rhddADAM15-His相对分子质量约76 000,以可溶性分子形式存在于发酵液上清中;纯化的融合蛋白纯度约为75%,可与兔抗rhddADAM15多克隆抗体特异性结合;融合蛋白对小鼠黑色素瘤细胞B16的迁移具有明显的抑制作用,但对其增殖无明显抑制作用。结论成功在毕赤酵母GS115中表达并纯化了HSA-rhddADAM15-His蛋白,为其作用机理的研究奠定了基础。

rhddADAM15抑制肝癌细胞Bel-7402增殖的作用研究

ADAM15属于跨膜蛋白ADAM家族中的一员,在乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等多种实体瘤中均发现其表达量提高。ADAM15在降解细胞外基质、介导细胞的黏附、细胞间信号转导及在肿瘤发展进程中起到重要作用。因其去整合素区域含有RGD序列,ADAM15可与多种整合素相互作用。在前期工作中,实验组利用大肠杆菌表达系统表达了重组人ADAM15去整合素区域蛋白,记作rhddADAM15。该研究将进一步针对rhddADAM15抑制肝癌细胞Bel-7402增殖的机理进行分析及探讨。SRB法显示,rhddADAM15可抑制Bel-7402细胞增殖并呈剂量依赖性,IC50为1.14μmol/L;利用DAPI核染发现,rhddADAM15可显著诱导Bel-7402细胞凋亡;流式细胞仪分析发现,rhddADAM15浓度为6μmol/L时,(87.44±7.25)%的细胞发生凋亡;PI单染分析细胞周期表明,rhddADAM15作用后,部分Bel-7402细胞周期被阻滞于S期及G2/M期,并呈剂量依赖性,4μmol/L rhddADAM15处理后G0/G1期含量下降约14%;Western blot分析显示,rhddADAM15可下调Bel-7402细胞周期蛋白CDC2的表达,抑制CDC2-Tyr15的去磷酸化,引起G2/M期的阻滞。

解聚素金属蛋白酶8、15、19在类风湿关节炎中表达研究

目的探讨解聚素金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase domain,ADAM)家族中ADAM8、15、19在类风湿关节炎(RA)中的表达研究。方法使用实时荧光定量PCR(real-time PCR)技术检测RA患者、骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者和痛风性关节炎(gouty arthritis,GA)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中ADAM8、15和19的表达,并且和疾病的炎症活动指标及标志性抗体进行相关分析,疾病炎症活动相关指标包括红细胞沉降率(erythrocytesedimentationrate,ESR)、C反应蛋白(C reactive protein,CRP),此外还包括RA的类风湿因子(rheumatoid factor,RF)和抗环瓜氨酸肽(anti-citrullinatedprotein antibody,anti-CCP)抗体。结果与对照者相比,ADAM8在RA、OA及GA组均增高,而正常对照者表达水平较低,差异有统计学意义(P=0.0001);ADAM8和疾病的活动性指标CRP具有相关性(r=0.330,P=0.002);ADAM15在RA、OA及GA中表达增高,但在RA中的表达升高尤其明显,差异有统计学意义(P=0.0035),ADAM15和RA的RF具有相关性(r=0.319,P=0.016);ADAM19只在RA中表达增高,差异有统计学意义(P=0.0086),ADAM19和RA的RF具有相关性(r=0.314,P=0.018)。结论 ADAM8参与了RA、OA和GA的发病过程,并与上述3种关节炎的活动性指标具有相关性。ADAM15及ADAM19主要参与了RA的发病,且ADAM15、ADAM19与RA的RF具有相关性。

IL-15及其受体在HIV感染中表达及意义

目的研究人免疫缺陷病毒(HIV)感染者外周血单个核细胞(PBMC)中白细胞介素15(IL-15)、白细胞介素15受体α(IL-15Rα)及解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)mRNA的表达,探讨其在HIV感染疾病进展中的作用。方法应用实时定量PCR(RT-PCR)检测9例HIV早期感染者(感染<1年,EHI组)、30例慢性HIV感染者(感染≥1年,CHI组)及9例健康对照(NC组)PBMC中IL-15、IL-15Rα、ADAM-17 mRNA水平。结果 CHI组PBMC中IL-15 mRNA的表达明显高于NC组(P<0.01);EHI组及CHI组PBMC中IL-15Rα、ADAM17 mRNA的表达明显高于NC组(P<0.05);HIV感染者PBMC中IL-15、IL-15Rα、ADAM17 mRNA的表达与病毒载量(VL)呈正相关(P<0.05); HIV感染者IL-15 mRNA表达与IL-15RαmRNA表达呈正相关(P<0.001), IL-15RαmRNA表达与ADAM17mRNA表达水平呈正相关(P<0.001)。结论 HIV感染后IL-15、IL-15Rα、ADAM17表达上调,皆与HIV病毒复制水平相关。