ADAM28基因原核表达载体的构建和在大肠杆菌中的融合表达

目的:利用消减杂交技术克隆出牙齿发育相关基因ADAM28。方法:本研究为构建ADAM28基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导其表达并纯化出ADAM28蛋白;采用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出ADAM28基因的蛋白编码序列,克隆到中间载体pMD18-TVector中产生pMD18-T-ADAM28,再经双酶切得到ADAM28片段定向克隆到pGEX-4T-1载体中,构建融合表达载体pGEX-4T-ADAM28;在大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达,得到GST-ADAM28融合蛋白,并经SDS-PAGE电泳初步纯化。结果:①成功构建融合表达载体pGEX-4T-ADAM28,并经酶切鉴定、PCR鉴定和测序验证显示插入的ADAM28序列正确,阅读框架完整,未发现突变。②得到初步纯化的GST-ADAM28融合蛋白。经IPTG诱导后出现一条约35.3×103的新蛋白带。结论:ADAM28基因编码蛋白质能够在原核细胞中表达并纯化,为进一步研究该蛋白质的功能打下基础。

牙齿发育相关基因adam28多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备及鉴定抗ADAM28的多克隆抗体。方法采用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出adam28基因的蛋白编码区序列,克隆到中间载体pMD18-T Vector中,再经双酶切得到adam28片段定向克隆到pGEX-4T-1载体中,构建融合表达载体pGEX-4T-adam28,在大肠杆菌中用IPTG进行诱导表达,得到GST-ADAM28融合蛋白,经过初步纯化及SDS-PAGE电泳,在35300的新蛋白带处直接割胶,作为抗原免疫新西兰大白兔后获取抗体。结果成功构建融合表达载体pGEX-4T-adam28,得到初步纯化的GST-ADAM28融合蛋白,免疫兔子1个月后,获得免疫血清,盐析法纯化得到多克隆抗体。Western印迹结果显示所得到的抗体具有较高的特异性,ELISA分析证实其效价可达1∶16000。结论成功制备出高效价的抗ADAM28多克隆抗体,为进一步研究ADAM28在牙齿发育中的作用和表达分布奠定基础。

ADAM28真核表达质粒的构建及转染人牙囊细胞后的表达分析

目的:构建金属蛋白酶解离素28(ADAM28)真核表达质粒,转染人牙囊细胞(HDFC)后检测ADAM28在HDFC中的表达分布。方法:采用基因重组技术构建ADAM28真核表达质粒,通过细胞培养、脂质体Lipofectamine2000介导转染HDFC后,应用免疫荧光、RT-PCR及Western印迹检测ADAM28在HDFC中的表达。结果:成功构建并鉴定ADAM28真核质粒,瞬时转染HDFC72h后,检测证实真核质粒转染组的HDFC表达ADAM28蛋白,而2个对照组均无表达。结论:ADAM28在HDFC内能被正确翻译和表达,为进一步探讨其在牙源性细胞中的生物学功能奠定了基础。

ADAM28基因对人牙囊细胞生物学特性的影响

目的探讨ADAM28基因对人牙囊细胞(HDFC)增殖、分化等生物学特性的影响及可能的作用机制。方法应用基因重组技术、细胞培养、基因转染、四唑盐比色法(MTT)、流式细胞术(FCM)和酶动力学方法探讨ADAM28基因对HDFC生物学特性的影响。结果成功构建并转染ADAM28真核质粒,系列检测显示:真核质粒转染组HDFC的增殖活性、增殖指数、ALP分泌活性明显高于空载体组及未转染组(P<0.01)。结论ADAM28可显著促进HDFC的增殖和ALP的分泌,并可能同时激活Notch信号途径,参与调控HDFC的增殖、分化和矿化。