miR-335-5p/ADCY3诱导的再生障碍性贫血患者免疫异常的机制研究

目的:探究miR-335-5p/ADCY3失衡对获得性再生障碍性贫血(AA)患者淋巴细胞功能的影响。方法:采集AA患者外周血标本50例,其中重型再生障碍性贫血(SAA)38例,非重型再生障碍性贫血(NSAA)12例,同时采集健康志愿者(HC)外周血标本22例。标本分离单个核细胞(PBMNC)后,用RT-PCR检测miR-335-5p及ADCY3 mRNA的表达量。用RNAimax转染试剂,将阴性对照miR-335-5p及miR-335-5p mimic分别转染至AA患者的PBMNC,流式细胞术检测CD4^+T和CD8^+T细胞增殖、活化及分泌细胞因子的能力。应用双荧光素酶报告基因系统验证miR-335-5p与靶基因的靶向关系。结果:同HC来源的PBMNC(HC-PBMNC)相比,SAA和NSAA来源的PBMNC中miR-335-5p的表达量均明显降低(0.08±0.01 vs 0.74±0.10,P<0.01^**;0.17±0.02 vs 0.74±0.10,P<0.01^**)。而且,SAA来源的PBMNC中miR-335-5p的表达量显著低于NSAA(P<0.01^**)。与对照组相比,体外上调miR-335-5p的表达,AA来源的PBMNC(AA-PBMNC)中,CD4+T和CD8+T细胞增殖能力均明显降低(P<0.05^*和P<0.05^*)。而且上调miR-335-5p的表达可显著抑制AA-PBMNC中CD4^+和CD8^+T细胞的活化(P<0.01^**和P<0.01^**)。此外,上调AA-PBMNC中,miR-335-5p的表达还可明显降低CD4^+TNFα^+T细胞、CD8^+IFNγ^+T细胞和CD8^+TNFα^+T细胞的比例(P<0.01、P<0.05和P<0.05)。靶基因筛查显示,ADCY3在AA-PBMNC中的表达量明显高于HC-PBMNC(1.70±0.15 vs 0.76±0.12,P<0.001)。而且,miR-335-5p可显著抑制ADCY33′UTR野生型质粒的荧光素酶活性(P<0.05)。结论:MiR-335-5p在AA-PBMNC中显著低表达,且与疾病严重程度相关。体外上调AA-PBMNC中miR-335-5p的表达量可纠正患者免疫异常状态。这些改变可能与靶基因ADCY3的抑制增强有关。

老年高脂血症患者血脂水平与ADCY3基因rs10187348位点基因多态性的关系

目的探讨老年高脂血症患者血脂水平与腺苷酸环化酶(ADCY)3基因rs10187348位点基因多态性的关系。方法568例老年高脂血症患者为研究组,并以同期128例健康体检者作为对照组。采集所有研究对象清晨空腹外周静脉血,并检测血脂等生化指标水平,并根据血脂指标异常情况将研究组分为4个亚组[高三酰甘油(TG)血症组、低高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)血症组、高总胆固醇(TC)血症组、混合型高脂血症组]。对ADCY3基因rs10187348位点基因分型进行分析,分为GG、CG、CC基因型。比较各组基因多态性分布情况,采用多元Logistic回归分析各遗传模型下基因多态性与血脂水平异常相关性,并采用多元线性回归分析ADCY3基因rs10187348位点基因多态性与血脂异常之间的相关性。结果ADCY3基因rs10187348位点分布3种基因型,且研究组和对照组中ADCY3基因rs10187348位点基因型(GG、CG、CC)期望值和观测值符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ^(2)=1.466,P=0.481;χ^(2)=2.854,P=0.240);两组的基因型分布之间存在显著差异(P<0.05),研究组CC型基因频率和C等位基因频率明显高于对照组,GG型基因频率和G等位基因频率明显低于对照组(P<0.05);研究组各亚组CC基因频率和C等位基因明显高于对照组,除混合型高脂血症组外,其他亚组GG基因频率和G等位基因频率明显低于对照组(P<0.05)。多元Logistic分析显示等位基因模型、加性模型、显隐性模型及纯合子模型下的ADCY3基因rs10187348位点基因多态性均与血脂异常之间显著相关(P<0.05)。多元线性回归分析结果显示基因型GG和CC均与各血脂指标水平显著相关(P<0.05),其中基因型GG是高脂血症患者的血脂异常保护因素,基因型CC属于血脂异常的独立危险因素。结论ADCY3基因rs10187348位点C碱基突变会增加老年人群血脂异常发生风险。

利用CRISPR/Cas9技术进行Adcy3基因编辑小鼠模型的构建与鉴定

目的:利用CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR- As-sociated 9)技术构建成功Adcy3 (Cyclic Adenosine-3&#39;,5&#39;-Monophosphate, cAMP)下游插入mCherry基因小鼠品系,为深入研究该基因的功能及相关疾病的治疗提供条件。方法:设计Adcy3基因sgRNA和mCherry供体,通过显微注射方式将Cas9mRNA、sgRNA和mCherry供体一同注射到C57BL/6小鼠受精卵中,获得Adcy3基因编辑小鼠。经过pcr鉴定和Sanger测序,对获得的子代小鼠,进行基因型的鉴定。结果:Adcy3基因编辑鼠构建成功,且能够通过正常繁育得到能够稳定遗传的子代小鼠。结论:建立了Adcy3-基因编辑小鼠模型,为小鼠体内Adcy3基因功能研究提供了新的小鼠模型。

ADCY3基因多态性与超重/肥胖的关联性研究

目的探讨腺苷酸环化酶3(adenylate cyclase 3,ADCY3)基因多态性与超重/肥胖的关系,并分析其对BMI和血脂水平的影响。方法采用整群随机抽样的方法抽取浙江省宁波市当地常住居民2279人。采用标签SNP方法筛选ADCY3基因的12个位点。采用连接酶检测反应技术进行基因分型检测。采用多重线性回归模型分析ADCY3基因多态性对BMI和血脂水平的影响,采用多因素logistic回归模型分析ADCY3基因多态性与超重/肥胖的关系。结果多重线性回归分析结果显示,在调整了年龄、性别和腰围后,发现rs4665273等9个位点多态性与BMI显著正相关;rs6751537等6个位点多态性与TC显著正相关;rs1127568等3个位点多态性与TG显著正相关;rs7608976等4个位点多态性与LDL-C显著正相关。多因素logistic回归分析共纳入849例超重/肥胖者,1331例正常者。在调整了年龄、性别等因素后,结果显示rs4665273等4个位点多态性与超重/肥胖相关。结论 ADCY3基因多态性影响BMI、TC、TG和LDL-C水平,可能与超重/肥胖发生风险有关。其中,rs4665273位点的TT基因型、rs7604576位点的AA基因型、rs2278485位点的GG基因型、rs10187348位点的CC基因型是超重/肥胖的危险因素。

ADCY 3和IGF 1基因结构变异与香猪繁殖性状的关联分析

试验旨在研究卵巢类固醇生成信号通路中腺苷酸环化酶3(adenylatecyclase 3,ADCY3)、胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor 1,IGF1)基因结构变异的遗传多样性及其与香猪母猪繁殖性状的相关性。采用PCR技术对269头香猪进行ADCY 3和IGF 1基因结构变异研究,利用在线软件计算遗传杂合度(He)、遗传纯合度(Ho)、有效等位基因数(Ne)及多态信息含量(PIC),并利用单因素方差分析、LSD法分析不同基因型与初产和经产香猪的总产仔数、产活仔数、初生重及乳头数等繁殖性状的关联性。结果显示,2个结构变异ADCY3-I_(1)-sv506和IGF1-I_(3)-sv302在香猪群体中均存在多态性,均有3种基因型:DD、DI和II,2种等位基因:D和I。其中,ADCY3-I_(1)-sv506中DI基因型为优势基因型(0.569),D为优势等位基因(0.601);IGF1-I_(3)-sv302中II基因型为优势基因型(0.717),I为优势等位基因(0.816)。ADCY3-I_(1)-sv506和IGF1-I_(3)-sv302多态信息含量(PIC)均为中度多态(0.25<PIC<0.5),杂合度分别为0.479和0.300。关联性分析结果发现,ADCY3-I_(1)-sv506位点DD基因型个体的初产和经产母猪总产仔数显著高于II基因型个体(P<0.05);IGF1-I_(3)-sv302位点II基因型个体的初产、经产母猪总产仔数和经产母猪产活仔数均显著高于DI基因型型个体(P<0.05)。结果表明,2个结构变异位点ADCY3-I_(1)-sv506和IGF1-I_(3)-sv302与香猪母猪的繁殖性能有直接关联,可作为香猪母猪繁殖性能选育的候选分子标记。