ADH1B对肝细胞癌合并脉管侵犯患者的预后价值及肝癌生物学行为的影响

目的探讨乙醇脱氢酶1B(alcohol dehydrogenase 1B,ADH1B)分子在合并脉管侵犯的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma with vascular invasion,VI-HCC)患者中的临床价值及对肝癌细胞生物学功能的影响。方法对VI-HCC组织进行RNA测序及GO、KEGG、GSEA、WGCNA等分析。采用免疫组织化学法检测组织中的ADH1B蛋白表达水平。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线并运用log-rank检验分析不同ADH1B蛋白表达组患者的生存差异,单因素及多因素Cox回归模型分析影响VI-HCC患者术后预后的独立危险因素,Spearman检验分析ADH1B与AFP、Ki67的相关性。用过表达ADH1B及其阴性对照的慢病毒感染肝癌Huh7细胞以构建ADH1B过表达的稳转株,采用qRT-PCR法检测细胞中ADH1B mRNA的表达水平。采用EDU、平板克隆形成实验检测细胞的增殖能力,Transwell侵袭、迁移实验及划痕实验检测细胞的侵袭、迁移能力,流式细胞术检测细胞的凋亡能力。结果RNA测序结果发现VI-HCC根治术后预后不良的患者原发瘤呈代谢重编程特征。免疫组织化学结果显示VI-HCC的癌组织中ADH1B蛋白表达水平显著低于癌旁正常组织(P<0.001);预后良好组患者的ADH1B蛋白表达水平显著高于预后不良组(P<0.05);ADH1B低表达可缩短患者的无复发生存期(relapse-free survival,RFS)和总生存期(overall survival,OS)(均P<0.01);ADH1B表达水平与AFP、Ki67水平呈负相关趋势(均P<0.01)。Cox回归模型结果显示,ADH1B低表达是影响VI-HCC患者术后RFS和OS的独立危险因素。细胞学实验结果发现过表达ADH1B可抑制细胞的增殖、侵袭、迁移能力,促进其凋亡能力(均P<0.05)。结论肝脏代谢-解毒相关基因ADH1B在HCC中表达下调且其低表达缩短VI-HCC患者的RFS和OS,可能的机制是ADH1B抑制HCC细胞的增殖、侵袭和迁移的能力,促进HCC细胞的凋亡能力。

人醇脱氢酶ADH1B*2等位基因的克隆与序列分析

目的克隆人醇脱氢酶ADH1B*2等位基因,并对克隆序列进行序列分析。方法用RT-PCR法获得ADH1B基因的cDNA,然后用双酶切得到目的基因并定向克隆到pUC19载体上。经蓝白筛选后,用限制性酶谱和DNA测序以及BLAST比对分析鉴定,并用SNPBLAST比对分析和查询dbSNP数据库,分析所克隆序列的单核苷酸多态性。结果证实所克隆序列为ADH1B*2等位基因。提示ADH1B*2等位基因有2个位点存在单核苷酸多态性。结论成功克隆了ADH1B*2等位基因,并进行了SNP分析。

ADH1B R48H多态性与口腔癌的关联研究

目的:检测乙醇脱氢酶1B(ADH1B)R48H多态性与口腔癌的关系。方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法在80例口腔癌患者和108例正常对照中进行基因分型,并用χ2检验检测ADH1BR48H多态性的基因型和等位基因频率在病例组和对照组中是否有差异。结果:ADH1B R48H多态性的基因型和等位基因频率在病例组和对照组的差异无统计学意义。结论:ADH1B R48H多态性可能在口腔癌的发生中不起主要作用。

过表达ADH1B基因HepG2.2.15细胞株的建立

目的构建ADH1B慢病毒表达载体并建立ADH1B稳定过表达的人肝癌细胞株HepG2.2.15。方法根据ADH1B基因序列设计引物,PCR扩增并连接于GV492载体质粒交换转化DH5α感受态,选取阳性克隆转化子进行测序鉴定。采用三质粒系统包装ADH1B慢病毒载体转染293T细胞收集上清,测定滴度。感染人肝癌细胞HepG2.2.15,嘌呤霉素筛选得到过表达ADH1B的稳定细胞株,设立空白组、阴性对照组和过表达组,通过荧光显微镜观察各组GFP表达情况,并用Western blot及RT-qPCR从蛋白、mRNA水平对ADH1B基因表达进行检测。结果通过PCR、酶切鉴定及基因测序成功构建ADH1B过表达慢病毒载体,检测病毒滴度为2×109TU·mL-1。利用此病毒悬液感染HepG2.2.15细胞,成功筛选到ADH1B稳定表达的HepG2.2.15细胞株。Western blot及RT-qPCR结果显示:重组慢病毒载体LV-ADH1B能够有效感染HepG2.2.15细胞,与空白组和阴性对照组细胞相比,在过表达组细胞ADH1B m RNA和蛋白中表达量均升高。结论成功构建ADH1B基因的重组慢病毒载体LV-ADH1B,并筛选出稳定过表达ADH1B基因的人肝癌细胞株HepG2.2.15。

乙醇代谢通路基因拷贝数变异与结直肠癌易感性的关联分析

目的探讨主要的乙醇代谢基因乙醇脱氢酶1B(ADH1B)、乙醛脱氢酶-2(ALDH2)和细胞色素P450 2E1(CYP2E1)拷贝数变异与中国西南地区人群结直肠癌(colorectal cancer,CRC)风险的关联。方法共纳入2001年1月至2004年6月陆军军医大学3所附属医院收集到的449例CRC和449例无癌对照。采用多重基因拷贝数定量方法 AccuCopy^(TM)对3个候选基因进行拷贝数检测,随机选取10%的样本进行拷贝数验证,采用二元Logistic回归分析CNV与CRC风险之间的关联。结果 ADH1B和ALDH2基因拷贝数在CRC病例和对照人群中没有变化,均为2拷贝。CYP2E1拷贝数在CRC患者和对照人群中分布差异有统计学意义(P=0.046)。Logistic回归分析发现CYP2E1拷贝数增加是CRC发生的危险因素(OR=2.47,95%CI:1.04~5.85,P=0.041)。分层后结果显示,年龄>50岁,肿瘤位于结肠,乙醇摄入量≤50 g的人群中,CYP2E1拷贝数增加与CRC风险具有关联。结论 CYP2E1拷贝数增加与中国西南地区人群CRC的发病风险具有显著关联。

ADH1B对鼻咽癌细胞的增殖及迁移能力的影响

目的:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)已成为我国头颈肿瘤患者的主要病死因素之一,局部治疗失败和远处转移是晚期NPC患者不良预后的主要原因。大量研究证明,ADH1B是多种癌症的风险基因,本研究探讨ADH1B在鼻咽癌细胞中的表达差异以及对鼻咽癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法:利用生物信息学方法分析ADH1B在头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSC)与正常组织中的相对表达量,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测正常永生化鼻咽上皮细胞NP69及鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2、5-8F、6-10B中ADH1B的mRNA表达水平,对比两种研究结果的一致性。在此基础上建立稳转ADH1B高表达鼻咽癌细胞系,以pCDH作为空载体对照。利用生长曲线实验检验鼻咽癌细胞的增殖能力,利用划痕实验检验鼻咽癌细胞的迁移能力。结果:生物信息学分析结果显示ADH1B在头颈鳞状细胞癌中表达量低于正常组织。qRT-PCR检测发现,ADH1B在鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2、5-8F、6-10B中均比NP69细胞表达低,过表达ADH1B组鼻咽癌细胞的生长曲线低于pCDH组(P<0.05),划痕愈合速度也低于正常表达组pCDH组(P<0.05)。结论:鼻咽癌细胞中ADH1B基因表达异常,明显低于正常鼻咽上皮细胞,与生物信息学分析结果一致。ADH1B基因在鼻咽癌中高表达影响鼻咽癌细胞的增殖和迁移,这与NPC的发生发展密切相关,可能是参与调控NPC发生发展的一个重要靶标。