人醇脱氢酶ADH1B*2等位基因的克隆与序列分析

目的克隆人醇脱氢酶ADH1B*2等位基因,并对克隆序列进行序列分析。方法用RT-PCR法获得ADH1B基因的cDNA,然后用双酶切得到目的基因并定向克隆到pUC19载体上。经蓝白筛选后,用限制性酶谱和DNA测序以及BLAST比对分析鉴定,并用SNPBLAST比对分析和查询dbSNP数据库,分析所克隆序列的单核苷酸多态性。结果证实所克隆序列为ADH1B*2等位基因。提示ADH1B*2等位基因有2个位点存在单核苷酸多态性。结论成功克隆了ADH1B*2等位基因,并进行了SNP分析。

过表达ADH1B基因HepG2.2.15细胞株的建立

目的构建ADH1B慢病毒表达载体并建立ADH1B稳定过表达的人肝癌细胞株HepG2.2.15。方法根据ADH1B基因序列设计引物,PCR扩增并连接于GV492载体质粒交换转化DH5α感受态,选取阳性克隆转化子进行测序鉴定。采用三质粒系统包装ADH1B慢病毒载体转染293T细胞收集上清,测定滴度。感染人肝癌细胞HepG2.2.15,嘌呤霉素筛选得到过表达ADH1B的稳定细胞株,设立空白组、阴性对照组和过表达组,通过荧光显微镜观察各组GFP表达情况,并用Western blot及RT-qPCR从蛋白、mRNA水平对ADH1B基因表达进行检测。结果通过PCR、酶切鉴定及基因测序成功构建ADH1B过表达慢病毒载体,检测病毒滴度为2×109TU·mL-1。利用此病毒悬液感染HepG2.2.15细胞,成功筛选到ADH1B稳定表达的HepG2.2.15细胞株。Western blot及RT-qPCR结果显示:重组慢病毒载体LV-ADH1B能够有效感染HepG2.2.15细胞,与空白组和阴性对照组细胞相比,在过表达组细胞ADH1B m RNA和蛋白中表达量均升高。结论成功构建ADH1B基因的重组慢病毒载体LV-ADH1B,并筛选出稳定过表达ADH1B基因的人肝癌细胞株HepG2.2.15。