嗜鞣管囊酵母adh2基因克隆及其原核表达

通过对不同酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因的多重同源性分析比对,克隆出嗜鞣管囊酵母P-01(Pachysolen tan-nophilus)乙醇脱氢酶Ⅱ基因的一段长为340 bp的片段(EU570211).利用RACE技术,扩增出嗜鞣管囊酵母P-01adh2基因的全长ORF(1 056 bp).将基因与pMD18-T载体连接,验证后测序.经酶切、酶连到表达载体pET-20b并成功构建了基因的原核表达载体pET-20b-adh2,在E.coliBL21(DE3)中诱导表达出adh2重组蛋白,主要以包涵体的形式存在,预期大小约为35 kD.

酵母ADH2-SUC2融合启动子的构建及其对基因表达的调控

将ＡＤＨ２基因的ＵＡＳ与带有不同长度缺失上游区的ＳＵＣ３基因融合，构建成４种具有不同融合启动子的ＳＵＣ２基因的表达质粒ＹＲＤ１１０１．ＹＦＤ１１０△９．ＹＦＤ１１０△１７、ＹＦＤ１１０△１１。将这些质粒及对照表达质粒ＹＦＤ２６△１．ＹＦＤ２５转化酵母菌Ｙ３３，在阻遏与去阻遏培养条件下，对各种转化子所产生的蔗糖酶进行了活性测定和组分分析。结果表明：在葡萄糖去阻遏生长条件下，ＹＦＤ１１０△１的启动子组合中ＵＡＳｓｕｃ２和ＵＡＳＡＤＨ２对ＳＵＣ２基因的表达有协同激活作用。在阻遏条件下Ｙ３３／ＹＦＤ１１０△１与Ｙ３３／ＹＦＤ１１０△９、Ｙ３３／ＹＦＤ２６△１、Ｙ３３／ＹＦＤ２５一样，均表达很低的糖基化蔗糖酶，３种去阻遏培养条件比较说明。

苋菜AtrADH2基因密码子偏好性与进化分析

ADH基因在甜菜色素生物合成酪氨酸途径中发挥着重要调控作用。为探究苋菜酪氨酸途径关键因子AtrADH2密码子的偏好性特征,本研究运用Codon W、EMBOSS、SPSS 24和Origin 2019b等软件分析了苋菜AtrADH2基因的密码子使用特征,与其他26个物种ADH2基因的密码子使用偏好性和6种常见模式生物的密码子使用频率进行比较。结果表明:苋菜AtrADH2基因密码子的使用偏好性较弱且偏好使用以A/T结尾的密码子,RSCU>1的有26个密码子;所有物种ADH2基因的CDS序列和RSCU值聚类分析在聚类上存在差异,但相似性很高,CDS序列聚类分析更能准确反映同源关系;不同物种ADH2基因密码子各成分均具有极显著相关性;苋菜AtrADH2基因的密码子基因位点更接近期望ENC曲线,突变压力是偏好性形成的主要因素;大肠杆菌和酵母菌均适合作为苋菜AtrADH2基因的异源表达受体,拟南芥是苋菜AtrADH2最理想的遗传转化受体。本研究为苋菜AtrADH2基因功能的进一步研究提供重要参考。

构建ADH2和THI3基因敲除酿酒酵母用于降低糯米酒中高级醇的研究

为了降低糯米酒高级醇含量,以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株XF1的单倍体XF1a7和XF1α6为原始菌,采用Cre/lox P同源重组系统构建乙醇脱氢酶基因ADH2和类丙酮酸脱羧酶基因THI3缺失的单倍体酵母,再通过单倍体的杂交构建ADH2单基因缺失双倍体酵母XF1-A和ADH2与THI3双基因缺失的双倍体酵母XF1-AT。结果表明,重组菌XF1-A、XF1-AT与原始菌XF1的生长性能相似,菌株XF1-A和XF1-AT的基本发酵性能与菌株XF1无显著差异,菌株XF1-A酿造糯米酒中高级醇含量为522.16 mg/L,比菌株XF1低11.16%;菌株XF1-AT的高级醇含量为462.03 mg/L,比菌株XF1低21.39%。综上,ADH2和THI3基因敲除酿酒酵母能够有效降低糯米酒中高级醇生成量。