酿酒酵母ADH3基因的敲除

设计含有与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)编码乙醇脱氢酶Ⅲ的ADH3基因ORF两侧序列同源的长引物,以质粒pUG6为模板进行PCR构建带有Cre/loxP系统的敲除组件。转化酿酒酵母YS3(Saccharomyces cerevisiae),并将质粒pSH65转入阳性克隆子。半乳糖诱导表达Cre酶切除Kanr基因,在YPD培养基中连续传代培养丢失pSH65质粒,在原ORF处留下一个loxP位点,获得ADH3单倍体缺陷型菌株。利用同样的方法再次敲除双倍体的另一个等位基因。最终获得ADH3双倍体基因缺陷型突变株YS3-ADH3。

基于ADH3基因的野生大麦系统进化分析

为探究大麦的遗传进化关系,选用91份来源于近东、中亚和我国西藏的野生大麦材料,基于乙醇脱氢酶Ⅲ基因(ADH3)对其进行系统进化分析。结果显示:近东野生大麦的单倍型个数(H=22)和遗传多样性(H_(d)=0.914,π=0.01265)均明显高于西藏野生大麦(H=5,H_(d)=0.753,π=0.01216)和中亚野生大麦(H=8,H_(d)=0.810,π=0.01110)。91份野生大麦材料主要被分成2个类群(Ⅰ和Ⅱ),81%的近东野生大麦和80%的西藏野生大麦聚类于Ⅰ类群;91%的中亚野生大麦与少部分近东和西藏野生大麦混合聚类于Ⅱ类群。同时,群体结构分析进一步佐证了西藏野生大麦与近东野生大麦之间的亲缘关系更近,与中亚野生大麦的亲缘关系较远。该研究结果明确了近东、西藏、中亚野生大麦的遗传进化关系,可为研究栽培大麦的起源提供分子依据。