苯并[a]芘作用下ADP-核糖基化修饰蛋白分析方法的建立

目的建立苯并[a]芘(B[a]P)作用下ADP-核糖基化修饰蛋白分析方法。方法使用免疫共沉淀技术收集可能发生ADP-核糖基化修饰的蛋白,同步使用高效液相色谱技术和双向电泳技术对蛋白进行分离,再进行MALDI-TOF-MS/MS鉴定,比较两种分离方法鉴定蛋白的差异,并将鉴定蛋白的氨基酸序列与文献报道的ADP-核糖基化修饰蛋白的保守序列进行比对。结果通过高效液相色谱分离结合质谱鉴定找出3个蛋白,双向电泳分离结合质谱鉴定找出12个蛋白,双向电泳分离结合质谱鉴定方法存在明显优势;所鉴定蛋白存在与文献报道的ADP-核糖基化修饰蛋白相似的保守序列。结论免疫共沉淀蛋白双向电泳分离结合质谱鉴定方法可用于分析ADP-核糖基化修饰蛋白,并发现ADP-核糖基化蛋白存在相对保守的结合序列。

大肠侧向发育型肿瘤细胞株ADP-核糖基化因子1的表达及其意义

背景与目的:侧向发育型肿瘤(Laterally Spreading Tumor,LST)有高恶变倾向。本研究目的是为了发现与大肠侧向发育型肿瘤(ColorectalLST,CLST)生长、发育方式密切相关的基因和功能蛋白,揭示LST侧向生长方式和高恶变潜质的分子肿瘤学机制。方法:应用全人类表达谱基因芯片筛选CLST、LoVo、SW480三株结肠癌细胞株差异表达的基因。从中选取差异比较显著的基因,应用半定量RT鄄PCR和蛋白免疫印迹从mRNA和蛋白表达两水平验证差异表达。结果:基因芯片筛查出LST相对于LoVo和SW480表达上调基因58条,下调基因39条。根据文献选取ADP鄄核糖基化因子1(ADP-ribosylationfactor1,ARF1)通过RT-PCR验证表达确实存在差异,而蛋白免疫印迹则显示CLST和LoVo的差异显著,和SW480的差别不显著。结论:CLST在基因表达上存在特殊性,其中ARF1在CLST表达水平较高,提示其可能介导与CLST特性有关的生物学功能,二者的相互关系值得进一步研究。

ADP-核糖基化因子抑制剂在实验性碱烧伤诱导角膜新生血管中的作用及其机制

背景角膜新生血管（CNV）是导致角膜盲的主要原因之一，研究表明，ADP一核糖基化因子（ARF）对肿瘤细胞的增生有调节作用，抑制ARF能抑制血管的形成，但ARF抑制剂对CNV是否发挥作用尚不清楚。目的探讨ARF抑制剂在碱烧伤诱导的CNV形成过程中的作用及其机制。方法7～8周龄清洁级雄性BABL／c小鼠60只按照随机数字表法分为PBS对照组和ARF抑制剂干预组，每组各30只。所有小鼠采用角膜碱烧伤诱导法构建CNV模型，ARF抑制剂干预组小鼠于造模后1周腹腔内注射0．5g／LARF抑制剂溶液0．5ml，每周3次，共1周，PBS对照组小鼠以同样方式注射0．5mlPBS。各组分别取24只小鼠，于造模后0、4、7、14d采用实时定量PCR（real—timePCR）和Westernblot法检测小鼠角膜组织中ARFmRNA和蛋白的动态表达，并于造模后14d，采用Westernblot法检测各组小鼠角膜组织中血管内皮生长因子（VEGF）的表达。各组另取6只小鼠，于造模后2、4、7、14d裂隙灯显微镜下观察CNV形成情况，并于造模后14d，采用全视网膜铺片免疫荧光组织化学法检测角膜组织中CD31在CNV中的表达。体外实验中应用ARF抑制剂干预人视网膜血管内皮细胞（RECs），CCK8法和细胞划痕法检测ARF对人RECs增生和迁移的影响。实验动物的使用和喂养遵循视觉及眼科学研究协会有关规定及苏州大学《实验动物管理及使用指南》。结果造模后PBS对照组和ARF抑制剂干预组小鼠角膜组织中ARFmRNA在各个时间点均有表达，在造模后14d达高峰，各组小鼠角膜中ARFmRNA的表达随着时间的延长而增加，差异有统计学意义（F时间=65．17，P=0．00），不同时间点的组间比较差异无统计学意义（F＊＊=1．98，P=0．18）；造模后14d，ARF抑制剂干预组实验后不同时间点ARF蛋白水平相对表达值比较差异有统计学意义（F=10．77，P=0．00）。裂隙灯显微镜下检查发现，ARF抑制剂干预组CNV相对面积为0．45±0．05，PBS对照组为0．72±0．11，2个组间差异有统计学意义（t=-3．87，P〈0．05）。全角膜铺片免疫荧光组织化学法检测表明，ARF抑制剂干预组小鼠角膜组织CD31表达面积明显小于PBS对照组。造模后14d，Westernblot法检测显示，ARF抑制剂干预组VEGF蛋白表达水平为1．20＋0．21，明显低于PBS对照组的2．47±0．33，差异有统计学意义（t=-5．62，P〈0．05）。CCK8法检测结果显示，随着ARF抑制剂质量浓度的增加，ARF抑制剂对人RECs的抑制率增加，差异有统计学意义（F=8．47，P=0．02）。细胞划痕实验后24h，100μg／L和1000μg／LARF抑制剂干预组人RECs迁移距离分别为（5．46±1．32）μm和（5．04±1．68）μm，与PBS对照组的（8．49±1．18）μm相比明显减小，差异均有统计学意义（t=-2．94、-2．91，P〈0．05）。结论ARF抑制剂能抑制碱烧伤诱导的CNV发生，可能与其下调VEGF的表达以及抑制血管内皮细胞的增生和迁移有关。

ADP-核糖基化因子1的功能及其与肿瘤相关性的研究进展

ADP核糖基化因子(ADPribosylationfactor,ARF)家族作为霍乱毒素催化GS蛋白ADP核糖基化反应的辅助因子,目前其病理生理作用仅对从功能角度定义的这一蛋白家族有价值,而进一步研究发现,ARF与高尔基复合体息息相关,在细胞内物质运输和信号转导过程中具有更加重要的生理功能。在这一蛋白家族中发现最早、研究最深入的是ADP核糖基化因子1。作者就此蛋白的调控分子和效应分子、功能及其与肿瘤的相互关系作一综述。

小麦ADP-核糖基化因子克隆及序列分析

二磷酸腺苷-核糖基化作用因子(ADP-ribosylation factors,ARFs)是真核细胞囊泡运输通道的关键组成成分,参与细胞运输和信号传导。根据GenBank中已知ARF基因序列设计引物,对小麦及其二倍体供体种基因组DNA进行PCR扩增、克隆、测序。结果表明:从小麦中克隆的ARF基因属于ARF1基因;与其他物种的ARF基因对比发现,该基因的内含子存在特殊的剪切方式。氨基酸序列分析表明,小麦的ARF同其他物种一样,具有保守的GTP结合区域。

ADP-核糖基化对大鼠肝、脾细胞核转录活性的影响

ADP-核糖基化对大鼠肝、脾细胞核RNA聚合酶(Ⅰ+Ⅲ)、Ⅱ[简称pol(Ⅰ+Ⅲ)、polⅡ]的转录活性均有抑制作用,对pol(Ⅰ+Ⅲ)活性的抑制率高于polⅡ,提示ADP-核糖基化是肝、脾细胞核RNA聚合酶,特别是pol Ⅰ活性的影响因素。当核糖化液中加入ADP-ribose转移酶(ADPRT)的特异性抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB),核糖基化对细胞核转录活性的抑制作用消失,进一步确证了RNA聚合酶活性的降低是由于ADP-核糖基化所致。

ADP-核糖基化调控精子形成的研究进展

ADP-核糖基化是由ADP-核糖基转移酶((ADP-ribosyl)transferases,ARTs)催化的一种蛋白质翻译后修饰,分为聚-ADP-核糖基化和单-ADP-核糖基化,在着丝点和纺锤体组装、DNA损伤修复及精子染色质重塑等多个精子发生生物学事件中发挥重要调控作用。部分ARTs基因缺失使精子形成异常,导致精液质量降低,甚至雄性不育。然而,ADP-核糖基化调控精子形成的详细机制尚不清楚,对单-ADP核糖基化的研究则更少。为此,本文综述了ADP-核糖基化在精子形成中的研究进展,以期为深入揭示精子形成调控机制提供新思路,推动雄性繁殖障碍防控和男性不育治疗取得新突破。

基于化学衍生和CID碎裂模式鉴定蛋白精氨酸-ADP-核糖基化的新方法

建立了一种新的基于碰撞诱导解离(CID)碎裂模式鉴定精氨酸-腺苷二磷酸(ADP)-核糖基化多肽的新方法.首先,在碱性条件下将精氨酸-ADP-核糖基化血管紧张素-Ⅰ转变为鸟氨酸化血管紧张素-Ⅰ,或在磷酸二酯酶和碱性磷酸酶处理下水解为精氨酸核糖基化血管紧张素-Ⅰ,然后对上述2种衍生物进行基于CID碎裂模式的串联质谱分析.结果表明,与未衍生的精氨酸-ADP-核糖基化血管紧张素-Ⅰ相比,在鸟氨酸化血管紧张素-Ⅰ和精氨酸核糖基化血管紧张素-Ⅰ的质谱图上发现大部分来自于肽骨架碎裂的离子峰,可提供足够的序列信息以确定精氨酸-ADP-核糖基化位点.

ADP-核糖基化样因子15与过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α基因单核苷酸多态性与糖尿病肾脏疾病的相关性研究

背景ADP-核糖基化样因子15(ARL15)基因rs4311394位点和过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)基因rs7656250位点已被证实与血脂紊乱密切相关,而血脂紊乱作为糖尿病肾脏疾病(DKD)的重要危险因素之一,其是否与DKD存在相关性尚未可知。目的探究ARL15、PGC-1α基因单核苷酸多态性(SNP)与DKD的相关性。方法选取2018-2019年于延边大学附属医院和延吉市医院确诊的朝鲜族和汉族2型糖尿病(T2DM)患者393例(记为T2DM组)、DKD患者90例(记为DKD组),同期选取在延边大学附属医院进行单位体检的健康人268例〔记为糖耐量正常组(NGT组)〕。检测所有受试者生理、生化指标,采用单碱基延伸法检测ARL15、PGC-1α基因rs4311394、rs7656250位点基因型,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测ARL15、脂联素蛋白水平。结果NGT组中汉族137例,朝鲜族131例;T2DM组中汉族205例,朝鲜族188例;DKD组中汉族55例,朝鲜族35例。NGT组汉族和朝鲜族人群ARL15基因rs4311394位点、PGC-1α基因rs7656250位点等位基因频率、基因型频率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。三组ARL15基因rs4311394位点、PGC-1α基因rs7656250位点等位基因频率、基因型频率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。三组ARL15、PGC-1α基因联合位点等位基因频率、基因型频率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。携带PGC-1α基因rs7656250位点CT基因型受试者空腹血糖(FPG)水平高于CC、TT基因型受试者(P<0.05);携带PGC-1α基因rs7656250位点CT、TT基因型受试者脂联素低于CC基因型受试者,TT基因型受试者脂联素低于CT基因型受试者(P<0.05)。T2DM组患者脂联素低于NGT组(P<0.05);DKD组患者ARL15、脂联素高于NGT组、T2DM组(P<0.05)。Spearman秩相关分析结果显示,ARL15与脂联素呈正相关(rs=0.372,P<0.05)。结论ARL15、PGC-1α基因SNP与DKD不相关,但携带PGC-1α基因rs7656250位点CT、TT基因型人群的脂联素水平下降。

ADP-核糖基化样因子-15及脂联素与2型糖尿病的相关性研究进展

2型糖尿病（T2DM）是以慢性血糖升高为特点的复杂性疾病,胰岛素抵抗（IR）或胰岛素分泌相对不足是T2DM发病的主要机制.据报道,我国糖尿病患病率为9.7%,患病人数近1亿,且近年来呈快速增长趋势.糖尿病可引起诸多并发症,2010年美国糖尿病协会的统计数据显示,10年以上病程的糖尿病患者出现并发症的几率高达98%.

延边地区朝鲜族ADP-核糖基化样因子15基因和内向整流通道蛋白J亚单位11号成员基因的基因单核苷酸多态与2型糖尿病的相关性

[目的]探讨ADP-核糖基化样因子15基因(ARL15)和内向整流通道蛋白J亚单位11号成员基因(KCNJ11)的单核苷酸多态(SNP)位点rs26770、rs5219与延边地区朝鲜族2型糖尿病(T2DM)的相关性.[方法]采用病例对照设计,选择延边地区朝鲜族307例,其中T2DM患者255例、糖耐量正常(NGT)人52例.利用单碱基延伸方法检测rs26770、rs5219的基因型.[结果]在显性遗传模型中,T2DM组KCNJ11基因携带rs5219位点的TT+CT基因型频率显著高于NGT组(P=0.001,OR=2.917, 95%CI:1.531~5.558);2个SNPs联合作用结果显示,T2DM组携带AA-CC和AG-CC联合基因型明显小于NGT组(P=0.008,OR=0.320, 95%CI:0.133~0.770;P=0.012,OR=0.357,95%CI:0.156~0.817).[结论]KCNJ11基因rs5219-T可能是延边地区朝鲜族人群罹患T2DM的易感因子,而携带KCNJ11和ARL15基因SNPs rs26770、rs5219的联合基因型AA-CC和AG-CC可能具有保护健康人群罹患T2DM的作用.

ADP-核糖基化样因子4C在脑胶质瘤中的表达及对替莫唑胺敏感性的影响

目的探究ADP-核糖基化样因子4C在脑胶质瘤中的表达及对替莫唑胺敏感性的影响。方法选取脑胶质瘤患者45例。收集患者临床资料,采用替莫唑胺化疗后对患者进行化疗耐药分析,RT-qPCR检测ADP-核糖基化样因子4C水平。结果ARL4C mRNA的表达水平与淋巴结转移、WHO分级密切相关(P<0.05),而与肿瘤大小、性别、年龄无关(P<0.05)。敏感组患者ARL4C水平显著低于耐药组(P<0.05)。ARL4C水平均是影响脑胶质瘤对化疗药物敏感性的独立危险因素(P<0.05)。结论ADP-核糖基化样因子4C在脑胶质瘤中的表达与淋巴结转移、WHO分级关系密切,且与替莫唑胺敏感性有关,旨在为脑胶质瘤的治疗提供临床指导意义。

食管癌组织ARL5B表达与临床病理特征的关系及作用机制

目的应用生物信息学技术探讨ARL5B的临床意义及可能的潜在作用机制,并通过临床资料、基础实验等进行了初步验证。方法从TCGA数据库下载食管癌数据集,R软件分析差异表达的mRNA,结合患者的临床数据集进行生存分析。取临床食管癌及癌旁组织标本,采用实时定量PCR(qRT-PCR)及蛋白印迹(Western blotting)验证ARL5B表达。免疫组化检测ARL5B表达并评价其与食管癌患者临床病理特征的关系。利用生物信息学对ARL5B潜在作用机制初步分析,qRT-PCR初步验证可能与其作用的基因。结果生物信息学结果显示ARL5B在人食管癌组织中的表达明显高于癌旁组织且ARL5B高表达是食管癌患者预后差的标志。淋巴结组织、肿瘤组织、癌旁组织中,ARL5B的mRNA和蛋白的表达由高到低,与生物信息学结果符合。临床分析表明ARL5B表达与肿瘤的淋巴结转移、临床分期有关,其高表达是患者预后差的标志。富集分析显示ARL5B与囊泡传输、内体传输、细胞器定位等生物学过程有关。蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析提示与ARL5B互作的蛋白质有VPS16、KIF1A、TOM1等。qRT-PCR验证表明,VPS16、KIF1A、TOM1的mRNA在食管癌组织中表达高于癌旁组织(n=60)且与ARL5B表达呈正相关。结论食管癌中ARL5B存在高表达,与肿瘤淋巴结转移、临床分期及预后有关;ARL5B可能通过多种分子机制调控参与食管癌进展。

ADP-核糖基化可逆修饰在DNA损伤应答及癌症治疗中的研究进展

细胞基因组DNA遭受到各种内外源因素的攻击可以诱发多种类型的DNA损伤.DNA损伤应答系统(DNA damage response,DDR)能及时识别、修复受损的DNA,维持基因组稳定性,避免肿瘤等多种疾病发生.DDR受到多种蛋白质翻译后修饰的严格调控,ADP-核糖基化(ADP-ribosylation)是其中最为重要的修饰类型之一.ADP-核糖基化是一种动态可逆的翻译后修饰,ADP-核糖基化与去核糖基化之间保持动态平衡,精密调控DNA损伤应答过程.鉴于ADP-核糖基化在DNA损伤修复中的独特功能,靶向这一可逆过程的抑制剂已被开发或有望作为一类用于癌症治疗的靶向药物.本文就ADP-核糖基化可逆修饰在DNA损伤修复及癌症治疗中的研究进展进行综述.

ADP-核糖基化调控泛素化修饰的研究进展

在生物体内,蛋白质翻译后修饰具有十分重要的作用,ADP-核糖基化和泛素化修饰作为2个重要的蛋白翻译后修饰类型,参与重要的生命活动。ADP-核糖基化在维持基因组的稳定性,转录调节、细胞分化与信号转导、肿瘤的发生发展等重要的生命活动相关。泛素化在蛋白质定位、代谢、功能、调节和降解中发挥重要作用,几乎参与一切生命活动的调控。蛋白翻译后修饰过程不是孤立存在的。

新型翻译后修饰调控固有免疫应答及其在炎症性疾病中的研究进展

翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs)是指特定的化学基团或蛋白质共价偶联到一个或多个氨基酸残基上的一种化学修饰,具有调节蛋白构象、活性、亚细胞定位及蛋白相互作用等功能。固有免疫是抵御病原体感染的第一道防线,但其异常活化与慢性炎症性疾病的发生发展密切相关。在此过程中,PTM通过调控关键信号蛋白的募集、稳定、基因转录等多个方面对固有免疫信号进行精确调控。近年来,除了磷酸化、泛素化等经典的PTM外,新型PTM如类泛素化修饰、ADP-核糖基化修饰、由细胞内小分子代谢物(例如:乳酸、琥珀酸、棕榈酸等)介导的修饰以及糖基化修饰同样参与调控固有免疫应答,其在炎症性疾病中的作用越来越受到关注。该文重点阐述了新型PTM调控固有免疫信号的重要作用及其在固有免疫异常活化所致的炎症性疾病中的功能。靶向异常的PTM将为自身免疫性疾病、慢性炎症疾病或感染性疾病的防治提供新的视角和思路。

ADP-核糖基化因子6抑制剂对真菌感染脓毒症致急性肾损伤的保护作用

目的 探讨ADP-核糖基化因子6抑制剂对脓毒症致急性肾损伤模型的保护作用。 方法 2018年2月将30只雄性BALB/c小鼠按随机数表法分为未感染组(5只)、氟康唑组(5只)、ADP-核糖基化因子6抑制剂组(10只)(简称抑制剂组)和生理盐水对照组(10只)(简称对照组)。氟康唑组、抑制剂组和对照组小鼠经尾静脉注射1×10^5 CFU白色念珠菌建立脓毒症致急性肾损伤模型,未感染组注射等量生理盐水。3 h后抑制剂组注射1.032 mg ADP-核糖基化因子6抑制剂,氟康唑组注射51 μg氟康唑,对照组注射与抑制剂组等体积生理盐水。处理后24 h根据体征及症状对小鼠进行脓毒症严重程度临床评分,用Jaffe检测法及酶偶联速率法测定小鼠血清肌酐及尿素氮,用HE染色法制作病理切片后,根据每张切片中肾皮质组织损伤的面积对肾组织进行病理评分。 结果 未感染组临床评分、血清肌酐、尿素氮和病理评分分别为0分、(0.98±0.38)μmol/L、(9.77±0.36)mmol/L、(0.88±0.30)分,氟康唑组分别为(0.80±0.84)分、(1.09±0.51)μmol/L、(9.64±0.17)mmol/L、(1.22±0.270)分,抑制剂组分别为(2.8±1.32)分、(1.43±0.50)μmol/L、(12.05±1.20)mmol/L、(2.04±0.55)分,对照组分别为(5.20±1.87)分、(2.96±1.55)μmol/L、(13.94±1.94)mmol/L、(2.67±0.55)分。未感染组与对照组比较,血清肌酐和尿素氮差异有统计学意义(P<0.05),说明造模成功;抑制剂组与对照组各项指标相比差异均有统计学意义(P<0.05)。 结论 ADP-核糖基化因子6抑制剂能减轻小鼠真菌感染脓毒症致急性肾损伤的程度。

绿脓杆菌外毒素A受体结合亚单位基因的克隆与表达

绿脓杆菌外毒素A(PEA)是绿脓杆菌感染的最主要致病因子,它由3个区域共613个氨基酸组成,分子质量66 ku。在体内,毒素先由Ⅰ区(受体结合亚单位)识别细胞表面受体并与之结合,而后,通过Ⅱ区(跨膜亚单位)将具有ADP-核糖基化活性的毒性单位导入胞浆,使Ⅲ区(毒力亚单位)发挥毒力作用,催化细胞内的延长因子2(EF-2)发生ADP-核糖基化反应,使EF-2灭活,抑制蛋白合成而杀灭细胞。在这种结合、入胞。

端锚聚合酶作为药物靶点的研究进展

端锚聚合酶(TNKS)属于聚腺苷二磷酸核糖聚合酶家族。TNKS与PARP家族的其它成员不同,它们具有两个独特的结构:SAM结构域和锚蛋白重复区。TNKS参与多种细胞功能调节,其中包括端粒的动态平衡、Wnt信号通路、葡萄糖代谢和有丝分裂期间纺锤体的形成等。TNKS主要通过聚ADP-核糖基化[poly(ADP-ribosylation),PARs]调节靶蛋白的稳定性来发挥作用。因此,TNKS的催化结构域是一个很有潜力的药物靶点。近年来,已有多个针对PARP家族的抑制剂进入不同的临床评估阶段,阿斯利康公司的奥拉帕尼、Clovis公司的瑞卡帕尼和默沙东公司的尼拉帕尼均已上市。该文对TNKS的结构、功能和抑制剂的研究现状进行概述。