魔芋ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基cDNA片段的克隆

利用ADP -葡萄糖焦磷酸化酶的保守序列设计引物 ,采用RT PCR方法 ,从白魔芋球茎组织的总RNA中扩增出目标cDNA片段 ,并克隆到pUC18载体中。序列分析后确认该片段属于一新的ADP

两个ADP-葡萄糖焦磷酸化酶α亚基基因在甘薯中的超量表达

ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化ADP-葡萄糖合成反应,是淀粉生物合成的限速酶之一。为研究甘薯AGPase与块根淀粉合成的关系,从高淀粉甘薯品种川薯34中克隆了AGPase基因的两个α亚基编码序列AGPa1和AGPa2;构建植物表达载体pC-AGPa1和pC-AGPa2后经根癌农杆菌EHA105介导分别导入甘薯品种西成薯007;获得表达了GUS的7株AGPa1和5株AGPa2转基因甘薯植株。RT-PCR和AGPase活性检测表明,AGPa1和AGPa2基因在转基因植株中表达水平高于对照,并引起甘薯叶片中AGPase活性显著增加。

甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶两个α亚基基因的克隆分析和植物表达载体的构建

ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化ADP-葡萄糖合成反应,是淀粉生物合成的限速酶之一。从高淀粉甘薯品种川薯34总RNA逆转录的cDNA中克隆了AGPa1和AGPa2两个α亚基编码序列,进行生物信息学分析后,插入植物高效表达载体pCamb ia1301构建了pC-AGPa1和pC-AGPa2两个双元表达载体,并导入根癌农杆菌EHA105中。获得的工程菌菌株可用于遗传转化甘薯、马铃薯和木薯等重要的薯类作物,为薯类作物高淀粉育种奠定了基础。

水稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的cDNA基因克隆和结构分析

用ＰＣＲ技术从我国水稻品种“中花１０ 号”（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ． ｊａｐｏｎｉｃａ ｃｖ． Ｚｈｏｎｇｈｕａ １０）的未成熟种子中克隆到ＡＤＰ－葡萄糖焦磷酸化酶基因，进行了全序列分析，并与国外已报道的同类基因进行了核苷酸及推导氨基酸序列的同源性比较。结果表明，作者克隆的ＡＤＰ－葡萄糖焦磷酸化酶基因全长１４６１ ｂｐ，编码１个由４８３ 个氨基酸组成的多肽，与国外基因的核苷酸和推导氨基酸同源率分别为９９．６％ 和９９．７％ 。此外，还对该基因进行了结构及进化分析。

两个类ADP-葡萄糖转运蛋白基因的克隆和特征

搜索数据库获得了2个新的类似ADP-葡萄糖转运蛋白(BT)基因的序列,通过PCR直接克隆了这2个基因。这2个基因都编码406个氨基酸组成的分子量为43 647Da的蛋白。BT2 A在蛋白氮端有一段59个氨基酸残基组成的叶绿体信号肽,而BT2 B的叶绿体信号肽长度为58个氨基酸。BT2 A在信号肽后的是一段71个氨基酸长可变区,碳端是276个氨基酸长的功能域;BT2 B可变区由72个氨基酸组成,碳端也是276氨基酸长的功能域。半定量PCR表明,BT2 A为组成型表达,而BT2 B则在胚乳发育的中晚期表达。BT基因进化树分析表明,BT2 A和BT2 B基因是在禾谷类作物分化后由基因倍增产生的。

水稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基Ⅰ基因的启动子分析

水稻(Oryaz sativaL.)基因组中的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基(ADP-Glucose pyrophosphorylase small subunit,OsAgpS)由两个基因编码,即OsAgpS1和OsAgpS2。其中OsAgpS1基因产生两个转录本OsAgpS1a和OsAgpS1b,区别在第一个外显子的位置不同。通过RT-PCR方法分析了两个转录本在水稻组织和胚乳不同发育时期的表达特性;同时通过报告基因GUS检测了两个转录本上游转录调节区DNA片段的转录启动特性。结果表明,两个启动子与其下游转录本的表达模式完全一致,即OsAgpS1a转录本和OsAgpS1a上游启动子控制的GUS基因主要在胚乳中高水平表达,在叶片中有很低水平的表达;而OsAgpS1b转录本和OsAgpS1b上游启动子控制的GUS基因主要在叶片和胚乳发育早期低水平表达。这说明OsAgpS1基因产生的两个转录本是由不同的启动子控制转录的,OsAgpS1a上游启动子可以作为胚乳表达用启动子。

马铃薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因多态性分析

ADP-葡萄糖-焦磷酸化酶(AGPase)是决定植物淀粉生物合成的关键酶,本研究以马铃薯AGP酶基因为候选基因,采用RT-PCR和测序技术检测22个不同类型马铃薯中该基因的遗传变异情况。结果表明,该基因存在多态性,22个品种马铃薯中存在5种类型的酶蛋白,酶蛋白基因型为ISQV时,马铃薯淀粉含量较高,AGP酶蛋白为VSKM和VLKM时,马铃薯淀粉含量较低。

小麦腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶同工酶类型及时空表达分析

以9个小麦品种为材料,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）同工酶类型、表达数量及亚基组成,分析AGP同工酶空间分布特点和器官表达特异性。结果表明：（1）小麦植株中共表达6种AGP同工酶,即AGPp、AGPs、AGPe1、AGPe2、AGPe3和AGPe4。（2）AGPp分布在种皮中,AGPs分布在种皮与叶片中,而AGPe1、AGPe2、AGPe3和AGPe4专一在胚乳中表达;在小麦籽粒灌浆过程中,AGPe1首先表达,AGPe2和AGPe3紧随其后,AGPe4最后表达。（3）AGP各同工酶均由大、小2个亚基组成,小亚基分子量为50 kD左右,大亚基分子量在51～54 kD之间。（4）AGP同工酶空间分布具有器官特异性,并在籽粒发育进程中顺序表达;AGPe3、AGPe1和AGPe2是占主导地位的AGP同工酶,且可能是决定AGP总酶活性的主效应酶,在灌浆后期籽粒淀粉合成中起关键作用。

西瓜wml15’端启动子区域对番茄的遗传转化及其转录调控功能研究

根据wml1 5’端启动子区域内部的限制性酶切位点,分离得到长度分别为1573bp、1197bp、896bp、795bp的片段,并与GUS基因融合构成转录融合体。用农杆菌介导法将这些片段转入番茄中,对转基因植株进行GUS活性分析,发现1573bp、1197bp、896bp的片段都能诱导GUS在授粉后15天、30天、45天的番茄果实中表达,且表达强度随果实发育而增强,而在叶片、茎、根中未检测到GUS基因表达。而795bp的片段转化的植株中则未检测到GUS基因表达。推定857bp至957bp之间的序列中包含了启动子行使正常功能必需的元件。

水稻AGPase小亚基基因的克隆测序及种质间遗传分化的研究

淀粉是构成和影响水稻产量和品质的最主要因素；ADP-葡萄糖焦磷酸化酶似GPase）基因是影响淀粉合成的关键酶基因之一。本研究用编码AGPase小亚基基因似GPsma）序列的特异引物（序列为F：5＇-TACGCTATGCTCTTGAAAC-3’；R：5＇-TATCTTCCCAGTAACCATCA-3＇）对普通野生稻（元江）、粳稻（榆密15）、籼稻（93—11）及籼粳交品系（南34）进行PCR扩增、克隆、测序和序列对比。又用该引物对来源于13个国家的15份AA基因组和5份CCDD基因组的共20份野生稻及205份包括40份籼稻和165份粳稻的云南地方品种和改良品种（系）进行PCR检测。在以上4个不同类型水稻材料该引物上扩增出184bp和215bp的2个片段均为AGPase小亚基基因的序列。在该序列的109bp处，元江普通野生稻和榆密15为T，而93—11和南34为C；籼粳交品系南34在121～151bp区间缺失31个碱基。所有的225份供试材料可分为3类。第一类具有215bp大小的条带，包括了全部的野生稻材料和196份籼粳材料。其中籼稻数占籼稻样本总数的95％，籼稻地方品种占籼稻地方品种总数的75％；粳稻数占粳稻样本总数的83．6％，粳稻地方品种占粳稻地方品种总数的60％。第二类具有184bp的条带，包括28个籼粳材料。第三类同时具有215bp和184bp的片段，此类只有1个父母本具不同片段的滇型杂交粳稻品种。结果表明AGPsma序列在野生稻中可能尚未出现分化，但在籼稻、粳稻和地方老品种及改良品种中都出现了遗传分化。

马铃薯AGPase活力反馈调控光合速率定量分析

为了揭示ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)改变对叶片光合作用的反馈调控,以改变AGPase活力的马铃薯转化株系为材料,测定了其AGPase活力(AA)、块茎淀粉积累量(SC)、叶片光合速率(PR)、叶绿素(CC)和蔗糖含量(SUC)等;测定结果分析显示,各株系的AGPase活力(AA)、块茎淀粉积累量(SC)和叶片光合速率(PR)间存在显著差异,且均显著高于对照;株系间AGPase活力、块茎淀粉含量和叶片光合速率呈显著正相关性;每单位AGPase活力上升可贡献贮藏器官淀粉积累增加2.5%,且是影响叶片光合速率的重要因素;结果表明,AGPase不仅是下游淀粉积累的限速酶,而且可向上游反馈调控光合速率。

玉米直链淀粉生物合成多基因转化载体构建

淀粉分支酶基因sbe是影响玉米直链淀粉含量的主要因素,淀粉分支酶分为3种即sbeI、sbeIIa和sbeIIb,其中sbeIIb对直链淀粉含量影响效应最大,抑制玉米淀粉分支酶sbeIIb基因的表达可减少支链淀粉的含量,从而达到提高直链淀粉的目的;ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)是直链淀粉合成的关键酶,通过提高AGP表达量同样可提高玉米直链淀粉含量。以此为目的分别克隆了sbeIIb一段375bp高度保守区,玉米SBE基因一段175bp内含子,AGP完整开放阅读框,大麦胚乳特异启动子和ADPG基因终止子。构建了sbeIIb基因正、反义的hpRNA发夹结构,将该发夹结构与上述基因分别连接到pCAM-BIA3301上;构建得到包含sbeIIb基因干扰结构与AGP基因过表达的pCAMB-RSA多基因胚乳特异表达载体。为此,pCAMB-RSA载体的成功构建将为高直链淀粉玉米的培育奠定基础。

玉米sh2和bt2基因的克隆及胚乳特异表达载体的构建

采用Trizol剂试提取玉米胚乳总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶编码基因bt2和sh2,并克隆玉米胚乳特异表达的isa基因启动子,利用酶切连接方法,构建bt2和sh2基因的单子叶植物胚乳特异表达载体。结果表明,bt2和sh2基因正向插入胚乳特异的ISA启动子和T-nos终止子之间,成功构建p3301-ISA-bt2-T35S和p3301-ISA-sh2-T35S植物胚乳特异表达载体。

烟草NtAGPase基因家族的鉴定及功能解析

淀粉是重要的碳水化合物,其组成和性质直接影响着烟叶的经济价值。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)是淀粉合成途径的关键性限速酶,但有关其基因特征、酶活性和代谢调控等在烟草中还未见详细报道。以拟南芥AtAGPase蛋白序列为索引序列,对烟草NtAGPase基因家族进行全基因组鉴定,通过Blast P比对及结构域分析,鉴定出烟草NtAGPase基因家族包含3个大亚基基因(NtLSU1、NtLSU2、NtLSU3)和一个小亚基基因(NtSSU);利用生物信息学工具对其编码蛋白序列进行解析。结果显示,Nt AGPase蛋白分子质量在57.03~58.43 ku,等电点在6.58~8.52;NtLSUs和NtSSU均定位于叶绿体上,属于质体型亚基;NtLSUs基因含有14~15个外显子,NtSSU基因仅含有9个外显子。三级结构预测结果显示,烟草Nt AGPase酶蛋白为异源四聚体,NtAGPase基因家族启动子区域含有多种与光、激素和逆境反应相关的响应元件,预示着其在光合作用、生长发育和逆境响应等过程中行使重要功能。系统进化树分析表明,烟草Nt AGPase蛋白与茄科植物马铃薯亲缘关系更近,而与模式植物拟南芥亲缘关系较远。研究结果可为进一步阐明烟草NtAGPase基因家族的功能及作用机制奠定基础。

小麦TaAGPL1基因上游转录因子TabHLH39的分离及其功能研究

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,AGPase)是作物淀粉合成的关键酶,由两个小亚基(small subunit,AGPS)和两个大亚基(large subunit,AGPL)组成,具有细胞质(cytosol)和质体(plastid)两种亚型。AGPL1是胞质型大亚基,对该酶活性的发挥具有重要功能。已有研究表明,过表达小麦胞质AGPase大亚基TaAGPL1-1D基因显著提高了小麦AGPase活性和淀粉积累速率,说明TaAGPL1-1D在淀粉生物合成中起着重要作用。将TaAGPL1-1D启动子与小麦籽粒cDNA文库进行酵母单杂交,筛选出一个转录因子TabHLH39,随后对TabHLH39与TaAGPL1-1D启动子之间的互作进行了验证;采用大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默技术,在田间小麦植株基因组内沉默了该转录因子,发现BSMV-VIGS-TabHLH39病毒沉默小麦植株籽粒的粒长、粒宽、粒重和淀粉含量均显著下降,且TaAGPL1-1D的表达水平也显著降低,表明TabHLH39可能通过正向调控TaAGPL1-1D基因的表达,参与了小麦淀粉的合成。

水稻胚乳中淀粉合成相关酶活性的变化对支链淀粉精细结构的影响

分析了水稻(Oryza sativa L.)籽粒发育过程淀粉生物合成途径中的关键酶——ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、可溶性淀粉合酶、淀粉分支酶以及淀粉脱支酶活性变化,同时研究了淀粉结构形成动态.与野生型晚粳9522相比,转基因晚粳9522中直链淀粉的合成被显著抑制,而总淀粉含量和籽粒终重量没有改变.淀粉生物合成途径中关键酶活性表达时间不一致,存在明显的时段特征,这与淀粉积累动态密切相关.可溶性淀粉合酶活性表达最早,其在灌浆前期驱动淀粉合成起始;而淀粉粒结合态淀粉合酶在胚乳发育的中期活性最大.两水稻实验材料间,除淀粉脱支酶活性变化有所不同外,ADP-葡萄糖焦磷酸化酶和淀粉分支酶活性的变化没有明显差异.并且,支链淀粉的分支模式在水稻籽粒发育过程中变化较大,且与品种有关.以上结果揭示,支链淀粉的合成要先于直链淀粉,并且在控制支链淀粉各分支的形成过程中有不同的酶在起特异的作用.