p53和NF-κB信号通路在MTB感染AECⅡ细胞中的免疫调控作用研究

目的:研究在结核分枝杆菌(MTB)感染肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)过程中,p53和NF-κB信号通路中相关信号分子是否参与了抗结核的先天免疫调控。方法:利用实时荧光定量PCR、Western blot和蛋白芯片技术,通过过表达和抑制AECⅡ细胞中的p53和NF-κB基因,分析在牛结核分枝杆菌弱毒株卡介苗(BCG)感染过程中p53和NF-κB信号通路的信号分子和细胞炎症因子的表达变化,并探讨p53与NF-κB信号通路在AECⅡ细胞抗MTB感染免疫应答中的“cross-talk”关系。结果:在A549细胞中,p53信号通路通过p53协同CBP来负调控NF-κB、TLR-4及TRAF6的表达,从而抑制NF-κB信号通路的活化,并上调IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ的表达;而NF-κB信号通路通过NF-κB协同TLR-4、TRAF6与CBP来负调控p53与MDM2的表达,从而抑制p53信号通路的激活,同时上调了IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ的表达。当BCG感染A549细胞时,p53信号通路中p53协同MDM2负调控CBP,进而上调NF-κB信号通路的TLR-4和TRAF6;同时,NF-κB信号通路通过TLR-4和TRAF6协同MDM2、CBP活化p53信号通路;细胞炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ的表达均显著上调。结论:在AECⅡ细胞中p53信号通路与NF-κB信号通路间存在拮抗作用;当受到BCG刺激时,p53信号通路与NF-κB信号通路表现出协同参与AECⅡ细胞抗MTB感染的免疫调控作用,本研究为深入探讨p53和NF-κB信号通路在肺泡上皮细胞抗结核中的免疫调控机制提供了理论参考。

砷暴露及雌激素受体拮抗剂对雌、雄胎鼠AECⅡ内ERβ表达的影响

目的观察砷暴露及雌激素受体拮抗剂(ICI182,780)对雌、雄胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)内雌激素受体β(ERβ)表达的影响。方法孕19~20dICR小鼠剖腹取胎鼠,分离、纯化雌性组和雄性组胎鼠AECⅡ。四甲基亚唑蓝(MTT)法确定亚砷酸钠(NaAsO2)染毒AECⅡ细胞的剂量。将AECⅡ细胞分为以不同剂量(低、中、高)NaAsO2染毒的砷暴露组,培养24h;另取AECⅡ细胞为联合暴露组,分别加入二甲基亚砜(DMSO)(溶剂对照组)、NaAsO25μmol/L(单独砷染毒组)、NaAsO2(5μmol/L)+ICI182,780(1×10-4 mol/L)(砷+拮抗剂组),培养24h;均设空白对照组(不加任何试剂)。24h后,砷暴露组行流式细胞术测凋亡率,砷暴露组、联合暴露组行实时荧光定量PCR法和Western blot检测胎鼠AECⅡ内ERβmRNA和蛋白的表达水平。结果AECⅡ纯度达(87.0±2.5)%。MTT法将0.5(低)、1.25(中)、5(高)μmol/L的浓度设置为染毒剂量。砷暴露组中:雌、雄中、高剂量组细胞凋亡率均高于空白对照组(P<0.05),而雌、雄各剂量组间比较差异无统计学意义。雌性中、高剂量组ERβmRNA和蛋白表达水平高于空白对照组(P<0.05)和同剂量组雄性(P<0.05);雄性各剂量组ERβmRNA和蛋白表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义。联合暴露组中:雌性单独砷染毒组ERβmRNA和蛋白表达水平高于砷+拮抗剂组(P<0.01)及同剂量组雄性(P<0.05),且高于空白对照组和溶剂对照组(P<0.05),雄性各组间比较差异无统计学意义;雌、雄其余各组间比较差异无统计学意义。结论砷暴露可使雌性胎鼠AECⅡ内ERβ表达上调且高于雄性,此过程可被雌激素受体拮抗剂阻断。

敲除Brg1基因对小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞数量和功能的影响及其机制研究

目的研究染色质重构复合物核心催化亚基(Brahma-related gene 1,Brg1)对C57BL/6小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞数量和功能的影响及其可能的机制。方法取6~8周龄雌性野生型C57BL/6小鼠(Wild type,WT)及Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cell Ⅱ,AECⅡs)上特异性敲除Brg1的C57BL/6小鼠(Brg1fl/fl)作为实验对象,每组选取8只小鼠,收取标本,利用免疫组化及免疫荧光分析肺组织中表面活性物质相关蛋白C(surfactant-associated protein C,SFTPC)阳性的细胞率,流式细胞术分析小鼠肺组织中表面活性物质蛋白C前体蛋白(prosurfactant protein C,pro SP-C)阳性的细胞(即AECⅡs)数量。Western blot检测各组小鼠肺组织中pro SP-C、SFTPC、表面活性物质相关蛋白A(surfactant-associated protein A,SFTPA)、表面活性物质相关蛋白D(surfactant-associated protein D,SFTPD)的表达水平。Western blot检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)表达及增殖相关信号转导途径中关键蛋白EGFR、p-EGFR、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT及NF-κB p65的活化水平。结果抗SFTPC免疫组化、免疫荧光显示其在肺泡上皮表达较WT小鼠增多(P<0.05);流式细胞术显示Brg1fl/fl组小鼠肺组织中pro SP-C+的细胞百分比较WT小鼠明显增高(P<0.05),Western blot检测结果显示AECⅡs的功能性蛋白pro SP-C、SFTPC、SFTPA及SFTPD在Brg1^fl/fl小鼠中明显增多;Brg1^fl/fl组小鼠肺组织中NF-κB p65及周期蛋白CyclinD1的表达增加,且p-EGFR/EGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT百分比显著提高,且差异均有统计学意义(P<0.05)。结论特异性敲除C57BL/6小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中的Brg1可促使AECⅡs数量和分泌功能的增加,其可能机制与敲除Brg1促进EGFR/PI3K/AKT/NF-κB信号通路的激活,且与增殖周期蛋白CyclinD1表达的增加有关。

不同体积分数氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞体外生长状态的影响

目的:探讨不同氧体积分数状态下,胎鼠原代肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar typeⅡepithelial cell,AECⅡ)体外生长状态的变化。方法:原代培养胎鼠AECⅡ并用电镜鉴定;建立氧体积分数0.95组(95%O2)、氧体积分数0.4组(40%O2)和空气组(21%O2)3种氧化损伤性细胞模型,各自暴露12、24 h和48 h;用倒置相差显微镜观察各组细胞的形态变化;四甲基偶氮唑盐反应比色法(MTT法)检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)浓度。结果:与空气组相比,氧体积分数0.4组在12、24 h存活率和凋亡率均无统计学差异,但48 h后出现统计学差异,ROS在24 h即出现统计学差异;氧体积分数0.95组每组均和空气组有统计学差异。此外,氧体积分数0.4组细胞的形态变化较氧体积分数0.95组损伤轻,但仍重于空气组。结论:体外40%O2的氧刺激在超过48 h以后,AECⅡ也会出现相应的氧化损伤。

醇醚羧酸/盐(Ⅱ)的绿色制备及性能研究

以脂肪醇醚(AEO9)、琥珀酸酐及NaOH为原料通过绿色的方法合成了新型醇醚羧酸(AECⅡ-H)和醇醚羧酸盐(AECⅡ-Na),并通过FT-IR对AECⅡ结构进行表征.与传统AEC的合成工艺相比,本实验中设计的AECⅡ的制备方法具有能耗低、反应条件温和、转化率高、安全性好的特点.将制得的AECⅡ从润湿性、乳化性及泡沫性与传统氯乙酸化法制得的AEC进行比较.结果表明,AECⅡ展现出优异的性能,这为今后的实际工业应用提供了一个新的选择.

高氧调节早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞CCAAT增强子结合蛋白α和肺泡表面活性蛋白的表达

目的探讨高氧状态下早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC2)中CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)和肺泡表面活性蛋白A(SP-A)、SP-B、SP-C、SP-D的表达及两者相关性。方法原代培养早产大鼠AEC2,利用950 mL/LO_2建立高氧细胞损伤模型,随机分为空气对照组和高氧实验组。分别于空气及高氧暴露后24、48、72 h,收获各组细胞。采用倒置相差显微镜观察各组细胞形态变化,实时荧光定量PCR及Western blot法分别检测C/EBPα和SP-A、SP-B、SP-C、SP-D mRNA及蛋白水平;CCK-8法检测细胞增殖。结果随培养时间延长,空气组细胞C/EBPαmRNA及蛋白表达逐渐降低,SP-A、SP-B、SP-C、SP-D mRNA和蛋白水平及AEC2增殖逐渐升高。高氧组细胞C/EBPα、SP-A、SP-B、SP-C、SP-D mRNA和蛋白水平及AEC2增殖呈先递增后递减趋势。与空气组相比,高氧组细胞C/EBPα、SP-A、SP-B、SP-C、SP-D mRNA和蛋白水平及AEC2增殖在高氧48 h明显增加。高氧组细胞C/EBPα蛋白水平与SP-A、SP-B、SP-C、SP-D蛋白水平及AEC2增殖呈正相关(r=0.96、0.98、0.92、0.97、0.90)。结论高氧暴露早期,C/EBPα可促进肺泡表面活性蛋白分泌,参与机体保护性调节作用,但随高氧暴露时间延长,丧失代偿保护作用。

豚鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、纯化与培养

为了建立豚鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)分离、纯化和ROCK抑制剂培养的方法,进一步以AECⅡ为模型研究其在抗结核分枝杆菌中的免疫调控作用奠定基础,试验利用混合酶溶液全肺灌注法消化、分离含有豚鼠AECⅡ的混合细胞,经过红细胞裂解液处理与免疫黏附法纯化获得AECⅡ。以3T3细胞为饲养层,并添加Rho激酶抑制剂的方法进行AECⅡ的传代培养。结果表明:混合酶溶液灌注消化法能充分消化肺脏上皮细胞,通过Ig G免疫黏附能有效去除巨噬细胞而纯化AECⅡ,并且在3T3细胞饲养层与ROCK抑制剂培养条件下促进了AECⅡ的体外增殖而抑制其分化。

肺泡Ⅱ型上皮细胞CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)的161位赖氨酸存在小泛素化修饰

目的明确人肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)中CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)能否发生小泛素相关修饰物(SUMO)修饰,并进一步鉴定其修饰位点。方法采用免疫荧光双标法检测C/EBPα和SUMO1在人AECⅡ中的表达情况。免疫共沉淀(Co-IP)检测C/EBPα和SUMO1在AECⅡ中的相互作用,明确人AECⅡ中C/EBPα能否发生SUMO化修饰。利用SUMOsp软件预测人C/EBPα的SUMO化修饰位点为C/EBPα上第161位赖氨酸(即K161),构建野生型GFP-C/EBPα质粒和突变型GFP-K161R质粒并转染AECⅡ,采用Co-IP鉴定C/EBPα的SUMO化位点。结果免疫荧光双标发现AECⅡ中SUMO1和C/EBPα存在共定位现象,且主要定位于细胞核中; C/EBPα和SUMO1的Co-IP结果出现C/EBPα-SUMO条带,提示C/EBPα能与SUMO1相互作用。野生型GFP-C/EBPα转染的AECⅡ中,可检测到C/EBPα-SUMO特异性条带,而突变型GFP-C/EBPα转染的AECⅡ中,不能检测到C/EBPα-SUMO特异性条带,提示C/EBPα的SUMO化修饰位点为C/EBPα第161位赖氨酸。结论人AECⅡ中C/EBPα能发生SUMO化修饰且其修饰位点为C/EBPα第161位赖氨酸。

右归饮对肺纤维化大鼠前列腺素及其受体的影响

目的探讨前列腺素及其受体EP2/EP3在右归饮改善大鼠肺纤维化中的作用机制。方法 SPF级雄性SD大32只采用随机数字表完全随机法分为正常组、模型组、右归饮低剂量组(右低组)、右归饮高剂量组(右高组)各8只。正常组无任何干预,模型及用药组经气管插管雾化博来霉素(6 mg/kg)建立实验性肺纤维化大鼠模型。造模后第14天右低组和右高组分别定时给予5 g/kg、10 g/kg右归饮灌胃1次,模型组等量饮用水灌胃,连续给药20 d。记录大鼠肺脏质量和体重,计算肺脏系数,ELISA法检测血清和肺组织中前列腺素E2(PGE2)的浓度,免疫组织化学染色分析肺组织中EP2和EP3的表达情况以及组织定位,分别计数阳性细胞数目。结果与正常组相比,模型组大鼠肺脏质量(3. 1±0. 44 g,P <0. 05)和肺脏系数(0. 69±0. 13%,P <0. 05)均病理性升高;血清PGE2为45. 49±7. 38 pg/ml(P <0. 05),肺组织中PGE2为113. 64±16. 78 pg/ml(P <0. 05),均显著升高;与正常组相比,模型大鼠肺组织实变区内可见大量EP2强阳性的AECⅡs异常增生,肺泡管和肺泡腔内大量聚集的巨噬细胞部分呈EP3阳性,EP2阳性和EP3阳性的细胞数量均显著增加(P <0. 05);与模型组比较,右低组大鼠肺脏质量(2. 63±0. 24 g,P <0. 05)和肺脏系数下降(0. 57±0. 08%,P <0. 05),血清中的PGE2(23. 01±8. 61 pg/ml,P <0. 05)和肺组织的PGE2(89. 84±20. 54 pg/ml,P<0. 05)水平均降低,EP2阳性的Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡs)细胞EP2表达减弱,细胞数量减少(P <0. 05),而EP3阳性的巨噬细胞数增加(P <0. 05),右高组除血清中的PGE2水平降低(P <0. 05)外,其他未见统计学差异。结论右归饮能够明显改善博来霉素所致大鼠肺纤维化,可能与降低肺脏组织中PGE2水平,抑制实变区EP2的表达,减少EP2阳性的AECⅡs数量,增加EP3阳性的巨噬细胞有关。

神经肽P物质对高氧损伤肺泡Ⅱ型上皮细胞氧化/抗氧化状态的影响

目的探讨神经肽P物质(Substance P,SP)对高氧损伤早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial celltypeⅡ,AECⅡ)氧化/抗氧化状态的影响。方法将分离培养的原代早产大鼠AECⅡ随机分为4组:空气组(将细胞置5%CO2、21%O2的孵箱中)、高氧组(将细胞置5%CO2、95%O2的密闭氧仓中)、高氧SP组(细胞培养液中预先加入5×10-8mol/L的SP,再置高氧中)和高氧SP受体拮抗剂组(细胞培养液中预先加入5×10-8mol/L的SP和5×10-7mol/L的L703.606,再置高氧中),各组细胞培养24 h后,镜下观察细胞形态的变化;MTT法检测细胞的增殖活力;流式细胞术检测细胞周期;JC-1探针法检测细胞凋亡早期线粒体膜电位的变化;化学比色法检测细胞丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、总抗氧化能力(Total antioxidative capacity,TAOC)及超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)的活力。结果与空气组比较,高氧组AECⅡ的增殖活力、S+G2期细胞比例、线粒体膜电位、SOD活力和TAOC均明显下降(P<0.01),MDA含量明显升高(P<0.01);与高氧组比较,高氧SP组AECⅡ的增殖活力、S+G2期细胞比例、线粒体膜电位、SOD活力和TAOC均明显升高(P<0.01),而MDA含量明显下降(P<0.01),SP受体拮抗剂可阻断该效应。结论 SP可明显减轻高氧导致的早产大鼠AECⅡ的氧化损伤,增强细胞的抗氧化能力,进而起到促进细胞增殖的作用。

不同浓度VEGF对AECII表达SP-B和TGF-β1的影响及意义

目的探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对肺泡II型细胞(type 2 alveolar epi-thelial cell,AECⅡ)表面活性蛋白-B(surfactant associated protein,SP-B)和转化生长因子-β1(transforming growth fac-tor beta-1,TGF-β1)表达的影响及意义。方法原代培养早产鼠AECII,采用real-time RT-PCR、细胞免疫染色等方法,观察VEGF对AECII SP-B及TGF-β1表达的影响。结果 Real-time PCR结果显示25ng/ml VEGF组与正常组相比SP-B mRNA表达水平明显上升(P<0.05)。25ng/ml VEGF组与正常组相比TGF-β1 mRNA表达明显下降(P<0.05),其他各组与正常组相比无统计学差异(P>0.05)。结论 VEGF在适宜浓度时有促进SP-B表达的作用,同时有抑制TGF-β1表达的作用,推测VEGF促进SP-B表达的作用与直接或间接抑制TGF-β1的表达有关。