POR基因敲除、回补及过表达LO2细胞株的构建及作为AFB_(1)染毒模型的初步应用

为了构建POR基因稳定敲除(POR^(KO))、回补(PORCO)、过表达(POR^(OE))的LO2细胞株,以便为后续深入开展POR基因在AFB_(1)致毒性机理中的功能研究提供细胞模型。本研究首先利用CRISPR/Cas9技术设计2条靶向POR基因的sgRNA并克隆至lentiCRISPR v2载体,进行慢病毒包装与感染,筛选出LO2 POR^(KO)单克隆细胞后进行测序及Western blot鉴定。其次用同源重组方法构建pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR重组质粒,经对POR^(KO)细胞和野生型细胞转染分别构建LO2 PORCO及LO2 POR^(OE)细胞株,以G-418筛选后进行Western blotting鉴定。再用4μmol·L^(-1)及8μmol·L^(-1)AFB_(1)分别对野生型、LO2 POR^(KO)、LO2 PORCO、LO2 POR^(OE)细胞株染毒48 h,观察细胞形态并测定细胞存活率。结果表明,靶向exon5的sgRNA-2可成功敲除POR基因,得到LO2 POR^(KO)细胞株;成功构建表达POR重组蛋白的LO2 PORCO及LO2 POR^(OE)细胞株。对AFB_(1)处理后的各细胞存活率测定结果表明,相较于野生型LO2细胞43.66%±0.58%和27.90%±0.46%的存活率,LO2 POR^(KO)细胞存活率具有极显著性差异,均为100%(P<0.0001);LO2 PORCO细胞存活率仍有显著性差异,分别为57.07%±0.74%和42.54%±0.68%(P<0.05);LO2 POR^(OE)细胞存活率则显著降低,分别为24.58%±0.92%和17.99%±0.81%(P<0.01)。综上所述,本研究成功构建了LO2 POR^(KO)、LO2 PORCO、LO2 POR^(OE)细胞株,并以AFB_(1)染毒处理分别研究了各细胞株的存活率和细胞形态学变化,发现POR基因对AFB_(1)所致细胞毒性的影响巨大。研究结果为后续深入开展POR基因在AFB_(1)致毒性机理中的功能研究奠定了基础。

枯草芽孢杆菌WTX1胞外酶降解AFB_(1)酶学特性及降解位点分析

为丰富生物降解黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))资源,研究已筛选到的枯草芽孢杆菌WTX1降解AFB_(1)的胞外酶特性及其降解位点。通过降解与AFB_(1)毒性位点结构相似的3种化合物,采用液相色谱串联三重四级杆质谱(UPLC-MS/MS)检测降解液。经层析分离,降解AFB_(1)胞外酶主要有Ea、Eb两种。最适降解条件:降解酶Ea降解温度为50℃,pH 5,降解率高达88.4%;降解酶Eb降解温度为37℃,pH 5,降解率为73.4%;Ea酶的作用位点为AFB_(1)的呋喃环双键、香兰素内脂环、戊烯酮环结构,Eb酶的作用位点为AFB_(1)的香兰素内脂环、戊烯酮环结构。酶组降解途径为通过水解作用,加氢及连续脱去-CO基团。菌株WTX1胞外酶通过水解作用破坏AFB_(1)毒性位点,起到降解作用,该酶具有很好的抗逆性,温度和pH适应性适合工业化加工的苛刻条件。

桦褐孔菌提取物对黄曲霉素B_(1)暴露小鼠肝损伤的缓解作用

[目的]探究桦褐孔菌提取物(IOE)对黄曲霉毒素B1(AFB_(1))暴露小鼠肝损伤的保护作用及机制。[方法]选取30只6周龄、体重相近的SPF级雄性C57BL/6小鼠,随机分为5组,对照组连续灌胃蒸馏水10 d;AFB_(1)组第1~7天连续灌胃蒸馏水,第8~10天连续灌胃2 mg/kg AFB_(1);不同浓度IOE组第1~7天分别连续灌胃25、50和100 mg/kg IOE,第8~10天各组均连续灌胃2 mg/kg AFB_(1),灌胃剂量均为0.2 mL,每天1次。试验结束后对小鼠称重并采集血液、肝脏组织,统计肝脏指数;通过苏木精-伊红(HE)染色观察肝脏组织病理变化;利用流式细胞仪分析肝脏细胞凋亡情况。通过细胞毒性试验,筛选AFB_(1)诱导AML12细胞损伤最适条件,并以此建立肝损伤模型,给予不同浓度IOE进行干预,利用CCK-8法测定细胞活力,确定IOE防治AFB_(1)诱导AML12细胞损伤的剂量范围。使用ELISA法检测血清和细胞中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量;利用实时荧光定量PCR检测肝脏和AML12细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)基因mRNA表达量;采用Western blotting检测肝脏和AML12细胞中NLRP3、Bax和Bcl-2蛋白表达量。[结果]与对照组相比,AFB_(1)组肝细胞排列紊乱、细胞肿胀,细胞凋亡率极显著升高(P<0.01);血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均极显著升高(P<0.01);肝脏中TNF-α、IL-6、IL-1β、NLRP3和Bax基因表达量均极显著升高,Bcl-2基因表达量极显著降低(P<0.01);NLRP3和Bax蛋白水平极显著升高,Bcl-2蛋白水平极显著降低(P<0.01)。与AFB_(1)组相比,不同浓度IOE组小鼠炎性细胞浸润减少,细胞排列整齐,细胞凋亡率极显著降低(P<0.01);血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量极显著降低(P<0.01);肝脏TNF-α、IL-6、IL-1β、NLRP3和Bax基因mRNA表达量极显著降低,Bcl-2基因表达量极显著升高(P<0.01);NLRP3和Bax蛋白水平均极显著降低,Bcl-2蛋白水平极显著升高(P<0.01)。细胞毒性试验结果显示,AFB_(1)诱导AML12细胞损伤最适条件为10μg/mL AFB_(1)作用24 h, IOE防治AFB_(1)诱导AML12细胞损伤的浓度梯度为1.5、3、6μg/mL。体外试验结果显示,AML12细胞中各炎性因子分泌、凋亡相关基因及蛋白表达量变化趋势与体内试验结果均一致。[结论]IOE可通过调节NLRP3、Bax和Bcl-2表达抑制炎性因子分泌,降低细胞凋亡,进而缓解AFB_(1)暴露引起的小鼠肝脏损伤。

不同层电荷数钙蒙脱石对黄曲霉毒素B_(1)的吸附性能与机理研究

以内蒙古、新疆及辽宁三地的钙基膨润土为研究对象,探究不同层电荷数钙蒙脱石对黄曲霉毒素B1(AFB_(1))的吸附性能与机理。采用X射线衍射仪、红外光谱仪、高效液相色谱仪等测试手段,研究不同产地膨润土的矿物学属性、理化性能及钙蒙脱石吸附AFB_(1)的动力学和等温吸附作用。结果表明,钙蒙脱石含量高、比表面积大、层电荷数高的内蒙古膨润土(N-Mt)吸附性能较好,当初始浓度为1.5 mg/L、吸附剂用量为5 mg时,N-Mt对AFB_(1)的饱和吸附量为1.153 mg/g,吸附过程受pH值影响较小。钙蒙脱石对AFB_(1)的吸附行为同时符合准一级动力学模型和准二级动力学模型,表明吸附过程可能同时涉及物理吸附和化学吸附。钙蒙脱石与AFB_(1)之间的吸附作用同时发生在层间域和层面上,该作用主要源于电子供体-受体结合作用和钙蒙脱石与AFB_(1)分子之间的离子-偶极相互作用。钙蒙脱石对AFB_(1)的等温吸附符合Langmuir模型,属单分子层吸附。

漆酶降解花生饼中黄曲霉毒素B_(1)的工艺优化及分子对接分析

为促进漆酶在花生饼粕中黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))脱除中的实际应用,以霉变花生饼为实验对象,利用漆酶降解AFB_(1),考察加酶量、体系pH、反应温度、反应时间及料液比对AFB_(1)降解率的影响,优化漆酶降解花生饼中AFB_(1)的工艺条件,并通过分子对接分析漆酶与AFB_(1)的相互作用方式。结果表明:漆酶降解花生饼中AFB_(1)的最优工艺条件为加酶量5 U/g、体系pH 6.0、反应时间48 h、反应温度45℃、料液比1∶10,在此条件下漆酶对花生饼中AFB_(1)的降解率高达83.5%,AFB_(1)残留量为15.8μg/kg,符合国标要求(≤50μg/kg);分子对接分析表明AFB_(1)与漆酶活性空腔中的氨基酸残基His109、Ser110、His111、Ser113、His452、Asp456间形成了氢键网络,漆酶降解AFB_(1)的机制可能与该氢键网络有关。综上,漆酶对花生饼中AFB_(1)具有高效的降解活性,在发霉花生饼脱毒处理中有较大应用前景。

降解AFB_(1)的克雷伯氏菌分离、鉴定及降解机理初步研究

为了获得对黄曲霉具有降解作用的菌株,以秸秆、牛粪、土壤、发霉玉米及花生为研究对象,以香豆素为唯一碳源,筛选获得了能够降解黄曲霉毒素B_(1)(AFB_(1))的多个菌株。通过生理生化及16S rDNA基因序列分析确定菌株种类;通过优化获得了对AFB_(1)具有最优降解效果的培养基组成;采用蛋白酶K和SDS处理发酵上清液,初步判断具有降解作用的物质;采用SDS-PAGE电泳分析比较了不同培养基中发酵培养基上清液的蛋白图谱,并选择差异条带进行质谱鉴定;采用不同萃取剂对降解后的产物进行萃取并进行全波长扫描与液质联用分析,确定降解产物的分子量,并对其可能的结构进行推测。结果表明:克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)N1在DJN培养基对黄曲霉毒素降解效果最好,37℃、72 h内降解率为74%,上清液中存在降解AFB_(1)的物质,初步推断为酶;差异蛋白条带质谱分析结果显示,对黄曲霉毒素有降解效果的酶可能为Mn-超氧化物歧化酶(SodA)或NADH-醌氧化还原酶(NuoB);降解产物的全波长扫描结果显示其最大吸收峰为310 nm左右;正丁醇作为最优萃取剂,采用LC-MS/MS对降解产物进行初步分析,结果显示其分子量为241.1,推测其呋喃环上的8、9位双键以及12位的甲氧基被破坏。

绿色富硒生物猪饲料中AFB_(1)达标生产工艺优化研究

饲料中黄曲霉毒素(AFB_(1))容易超标,检出率达80%~100%,毒性大,具强致癌性,可抑制生猪免疫机能,降低动物生产性能,引起动物继发感染,还会在动物产品中残留而威胁人类健康,给生猪养殖带来经济损失,降低猪肉食品安全性。本文通过使用先进固体发酵系统设备和益生菌发酵技术,采用单因素试验和响应面中试优化,获得发酵降解猪饲料AFB_(1)的最佳工艺参数为硒浓度0.3 mg/kg,发酵时间12 h,量子波强度30 Hz,益生菌菌种组合CGMCC NO.17328混合CGMCC NO.15611。该工艺将猪饲料AFB_(1)量从63.41μg/kg降解到2.98μg/kg,降解率达到95.30%,AFB_(1)含量达到国家饲料安全标准。生产工艺适合养猪场低成本快速生产AFB_(1)达标猪饲料。

自还原MXene负载金的适体传感器检测小米样品中的黄曲霉毒素B_(1)

该文研究一种基于负载金纳米颗粒(Au nanopaticles,Au NPs)的MXene复合纳米材料(Au NPs@MXene)的电化学适体传感器,可对黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))进行敏感检测。利用了MXene特殊的二维结构及其自身的还原性,简单、快速、高效地将Au NPs原位生长在其表面。所合成的材料具有优异的导电性、比表面积较大、较电催化活性好,可作为电化学生物传感器的基底材料。在最佳试验条件下,传感器对AFB_(1)的检出限为6.3 pg/mL(信噪比为3),线性范围为0.05 ng/mL~100 ng/mL。该传感器已应用于小米样品中AFB_(1)的测定,且在其他食品基质中也具有较大潜力。

检测角度对激光诱导荧光光谱技术检测花生油AFB_(1)污染的影响研究

近年来,近红外光谱、高光谱等快速无损检测技术,被广泛应用于农产品中黄曲霉毒素B_(1)(Aflatoxin B_(1),AFB_(1))的检测。但这些方法主要是根据黄曲霉改变样品本身的结构结合化学计量学方法间接检测样品中AFB_(1),无特异性。因此,本研究拟利用自主研发的激光诱导荧光(laser induce fluorescence,LIF)技术获取污染AFB_(1)花生油的荧光光谱,建立精确无损检测花生油中AFB_(1)的定性、定量方法。首先,人工制备7种不同AFB_(1)污染水平的花生油样品,同时设置对照组。其次利用研发的LIF系统从不同角度检测样品的荧光光谱信号。最后,对获取的光谱进行分析。结果显示,三个检测角度的荧光强度在400~800 nm内均随着AFB_(1)污染水平的增加而增加,定性和定量的结果均是当检测荧光角度为90°时表现最优。表明当检测角度为90度时,LIF技术可以作为一种快速、精确的方法来判定花生油中AFB_(1)污染水平。

低温等离子体对黄曲霉毒素B1的降解效能

目的:确定低温等离子体降解黄曲霉毒素B_(1)(Aflatoxin B_(1),AFB_(1))最佳工艺条件,并探究其在农产品中应用的可行性。方法:选取低温等离子体不同激发条件(峰值电压、工作频率、作用时间),研究其对溶液中AFB_(1)的降解效果。通过Center Composite Design(CCD)法进行响应面试验,获取最优降解组合及各因素交互作用机制,并考察此条件下玉米中AFB_(1)降解效果。结果:当AFB_(1)浓度为1000μg/L时,其降解率随峰值电压及作用时间(除90~120 s)的增加,工作频率的下降而极显著升高(P<0.01)。响应面优化后最佳工艺条件为峰值电压160 kV、工作频率50 Hz、作用时间165 s,此时AFB_(1)降解率为99.62%。此外,将优化后的降解条件在受AFB_(1)污染的玉米(23.18±0.06μg/kg)中进行应用,发现180 s处理时间下,其降解率可达39.29%。结论:通过CCD法确定了低温等离子体技术降解AFB_(1)最优工艺,证实了其在玉米中的降解效果。表明低温等离子体技术在降低谷物黄曲霉毒素污染方面具有巨大潜力。

家禽饲料中主要霉菌毒素含量与家禽肉、内脏、鸡蛋霉菌毒素含量的相关性分析

试验旨在研究家禽饲料中的主要霉菌毒素与家禽肉、内脏和鸡蛋霉菌毒素含量的相关性。本试验对山东省各地市分别取有代表性的16个肉鸡养殖场(每场采集饲料1份和3只肉鸡的胸肉、腿肉、心脏、肝脏)和14个蛋鸡养殖场(每场采集4枚鸡蛋和1份饲料)进行霉菌毒素检测。结果表明:肉鸡配合饲料中黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤酶烯酮(ZEN)和脱氧血腐镰刀菌烯醇(DON)的检出率分别为93.75%、100%和87.5%,1份AFB1超标饲料中含量为15.02μg/kg时,肉鸡肝脏中AFB1毒素残留量仅为0.012μg/kg。肉鸡饲料中ZEN为502、558、672.5μg/kg时,肝脏ZEN含量分别为0.25、0.354、0.405μg/kg,在其他组织中未发现ZEN毒素残留。肉鸡饲料AFB1、ZEN和DON不超标,肌肉和脏器中没有检出AFB1、ZEN和DON。蛋鸡配合饲料AFB1、ZEN和DON的检出率分别为100%、100%和93.75%,且含量均低于限量标准,3种毒素在鸡蛋中均未检出。饲料中AFB1、ZEN和DON含量低于限量标准时,在肌肉、脏器和鸡蛋中未能检出。饲料中AFB1、ZEN含量高于限量标准,肝脏可检出AFB1、ZEN。肝脏是毒素的主要存留器官,肝脏ZEN含量与饲料中ZEN含量呈显著相关性(R2=0.8558)。由以上结果可知,肉鸡饲料AFB1、ZEN含量超标,肝脏可检出相关毒素,其他脏器未检出;肝脏ZEN含量与饲料中ZEN含量呈显著相关性;饲料中AFB1、ZEN和DON含量低于限量标准时,3种毒素在肌肉、脏器和鸡蛋中未能检出。

ELISA法检测红曲中的黄曲霉毒素B_1

探讨了红曲中黄曲霉毒素B1的提取方法,发现在传统提取方法甲醇/水溶液(体积比1∶1)直接提取的基础上加氯仿进行液液萃取后,进行ELISA法测定其含量,可以消除假阳性,同时提高了检测灵敏度.在加标质量分数分别为2.5,5,10μg/kg时,加标回收率达到101%～146.8%,方法的重复性较好,变异系数小于13%,样品最低检测限达2.5μg/kg.

黄曲霉毒素B_(1)对动物危害作用研究

黄曲霉毒素是一类强毒性的真菌毒素。该文综述了黄曲霉毒素的概述、理化性质、对畜禽机体和雄性生殖生理的毒性作用,以及黄曲霉毒素B_(1)的检测和脱毒技术,以期为黄曲霉毒素防治措施提供参考。

黄曲霉毒素B_(1)致病机制及防治研究进展

黄曲霉毒素(aflatoxins,AFs)是一类来自于霉菌中的剧毒物质,其中以黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))的毒性最强、危害性最大。AFB_(1)是一种具有强致癌性及剧烈毒性的双呋喃环类毒素,广泛分布于霉变的玉米、花生、大米和大豆等粮油作物中,由AFB_(1)引发的人与动物中毒事件给当前食品安全和畜禽养殖等行业的发展造成了严重危害。AFB_(1)已被证明能够引起机体氧化应激、细胞凋亡、细胞焦亡、基因突变及免疫系统损伤。作者阐述了AFB_(1)抑制机体免疫系统、破坏机体免疫耐受性的免疫毒性作用;介绍了AFB_(1)促进活性氧生成、激活Nrf2-ARE通路、诱导机体氧化应激和炎症反应进而造成器官损伤的器官毒性作用;分析了AFB_(1)利用细胞死亡相关受体调控外源性细胞凋亡作用,以及通过一系列细胞凋亡相关蛋白诱导内源性细胞凋亡作用,还可利用肝细胞经典焦亡途径引发炎症反应,继而引发非正常死亡的细胞毒性作用;回顾了近年来关于AFB_(1)基因毒性与其去毒措施的作用机制及其研究进展。本综述有望为针对AFB_(1)致病机制的深入研究及相关防治药物的研发提供参考,并为发霉粮油作物的去毒措施的选择提供有效依据。

ELISA法检测油菜籽中的黄曲霉毒素B_(1)

为了建立油菜籽中黄曲霉毒素B_(1)(Aflatoxin B_(1),AFB_(1))的快速检测方法,本文采用酶联免疫吸附法,选取不同浓度的提取液、不同种类、不同比例的稀释液检测样本的加标回收率,并进行了准确度、精密度及重复性的评价。结果发现用60%甲醇1︰5、超纯水1︰4稀释检测油菜籽样本中黄曲霉毒素B_(1)的加标回收率为99%~106%,相对标准偏差小于5%。结果表明,酶联免疫吸附法测定油菜籽中黄曲霉毒素B_(1)含量的准确性,重现性,稳定性好,可广泛用于油菜籽中黄曲霉毒素B_(1)的检测。

基于免疫层析图像可视化的黄曲霉毒素B_(1)快速定量方法

黄曲霉毒素B_(1)是一种毒性最大的黄曲霉毒素,与人类肝癌的病因有关。以黄曲霉毒素B_(1)胶体金检测卡为载体,将黄曲霉毒素B_(1)检测信息通过胶体金检测技术进行可视化呈现。采用电荷耦合器件记录检测信息,利用颜色空间进行数学建模,并将可视化信息进行数字化提取。通过建立的模型途径将获取黄曲霉毒素B_(1)含量的信息进行识别与表达。结果表明:制备的黄曲霉毒素B_(1)胶体金检测卡T线和C线的颜色距离与AFB_(1)样品浓度呈线性相关(R^(2)=0.986)。图像信息显示,质量浓度为20μg/kg的平行样间的相对标准偏差小于2.7%的点占97%;质量浓度为10μg/kg时,相对标准偏差小于3.6%的点为90%;质量浓度为5μg/kg相对标准偏差小于4%的点达到96%以上。本研究方法获取的线性结果与人工试验所得的线性结果间最大误差为5.93%,与高效液相色谱试验结果对比,无显著性差异(P>0.05)。该方法能够同时对多个层析检测卡样本信息进行记录,实现一次检测试验可以完成多个样品多指标定量检测和结果输出,为黄曲霉毒素B_(1)的快速定量提供了一种有效途径。

硒代蛋氨酸对黄曲霉毒素B1致家兔肺损伤的保护作用

硒代蛋氨酸(selenomethionine,SeMet)被认为具有良好的抗氧化性能,可以调节机体的多种生物功能,是一种良好的有机硒源。越来越多的证据表明,有机硒对预防霉菌毒素中毒有明显的拮抗作用,因此,本试验选取SeMet,旨在探讨SeMet对黄曲霉素B1(aflatoxin B1,AFB1)致兔肺部组织损伤的保护作用。将50只35日龄家兔分为5组,分别为对照组(基础饲粮)、模型组(0.3 mg/kg AFB1+基础饲粮)、低硒剂量组(0.2 mg/kg SeMet+0.3 mg/kg AFB1+基础饲粮)、中硒剂量组(0.4 mg/kg SeMet+0.3 mg/kg AFB1+基础饲粮)、高硒剂量组(0.6 mg/kg SeMet+0.3 mg/kg AFB1+基础饲粮),试验期共21 d。试验结束后,计算肺脏指数,进行HE染色和Masson染色并检测肺脏的氧化因子和炎性因子的含量。HE染色结果显示,模型组中肺部组织充血严重,毛细血管和支气管周围渗出大量的红细胞,肺间质红细胞浸润,肺泡囊体积缩小,Ⅱ型肺泡细胞萎缩、胞质浓缩、细胞核皱缩,淋巴细胞和巨噬细胞明显增多;Masson染色结果显示,模型组肺脏纤维化明显;饲料中添加SeMet可以改善家兔AFB1中毒引起的肺脏病理损伤。补充SeMet还提高了GSH-Px、SOD和T-AOC的活性,显著降低了MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量,有效缓解了AFB1中毒引起的氧化应激和炎症反应。综上所述,饲料中添加SeMet可以通过提高抗氧化酶的活性,降低炎性因子的表达,有效地改善AFB1致家兔肺脏的损伤,0.2 mg/kg SeMet的改善效果最为显著。

鱼干曲霉菌分离株鉴定及产毒特性

【目的】探明湛江市售鱼干中曲霉菌(Aspergillus spp.)分离株产AFB_(1)的特性。【方法】采用马铃薯-葡萄糖琼脂(PDA)对鱼干中的曲霉菌进行分离纯化,根据菌落形态、显微形态观察和ITS序列分析对分离株进行鉴定,采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法分析菌株的AFB_(1)合成量。【结果】鱼干中曲霉菌的分离率高达47.66%,经形态学鉴定发现以黄曲霉(Aspergillus flavus)A03、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)H32、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)M23、欧式曲霉(Aspergillus europaeus)M11、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)B21等为主,其中红笛鲷干(Lutjanus sanguinaus)中黄曲霉菌的含量高达1200 CFU/g。黄曲霉A03在红笛鲷干培养基中常温(27~30℃)培养21 d,产AFB_(1)能力达到3.8 ng/mL。【结论】鱼干中存在产AFB_(1)的黄曲霉菌,警示鱼干中存在AFB_(1)污染的风险。