枸杞属AFLP分析体系优化与建立

以枸杞属种质资源为试材，对AFLP分析过程中包括DNA的提取质量和浓度、Mse I／EcoR I以及T4DNA连接酶的浓度、反应时间等影响因素进行了研究。建立了一种适于枸杞AFLP银染技术的优化体系。该体系中各优化因素为：模板DNA的用量为300-400ng，酶切体系中Mse I和EcoR I各加入3U，T4 DNA连接酶加入2．0U，采用酶切与连接在同一体系中一步完成，其酶切温度为37℃，反应时间为5h。与22℃连接过夜。并对预扩增、选择性扩增和银染的效果进行了检测，以引物M＋CAC／E＋AGG构建了枸杞种质资源的AFLP指纹图谱，该图谱扩增带多，多态性强，且质量好。

烟草AFLP分析体系的建立与优化

以10份烟草种质资源为试材,对AFLP分析过程中包括DNA的提取质量和浓度、MseⅠ/EcoRⅠ以及T4DNA连接酶的浓度、反应时间和反应温度、以及其反应体系的组成等影响因素进行了研究。建立了一种适于烟草AFLP银染技术的优化体系。该体系中各优化因素为模板DNA的用量为400ng,酶切体系中MseⅠ和EcoRⅠ各加入4U,T4DNA连接酶加入2.8U,采用酶切与连接在同一体系中一步完成,其酶切连接温度为37℃,反应时间为7h。并对预扩增、选择性扩增和银染的效果进行了检测,以引物E-ACT/M-CAC构建了烟草种质资源的AFLP指纹图谱,该图谱扩增带多,多态性强,且质量好。

杜仲AFLP反应体系的建立及优化

【目的】建立并优化适合杜仲的AFLP技术体系,为进一步构建其遗传图谱及开展分子标记辅助育种奠定基础。【方法】对杜仲基因组DNA提取方法、酶切与连接体系、预扩增和选择性扩增程序的影响因素进行分析,并对适合杜仲AFLP分析的引物组合进行筛选。【结果】模板DNA的提取采用改进的CTAB法,酶切模板DNA用量500 ng,酶切时间6 h,连接反应时间6 h,预扩增产物最适稀释倍数30倍。同时筛选出E-AAG+M-CAA,E-AAG+M-CAT,E-AAG+M-CTA,E-AAG+M-CTG,E-ACA+M-CAA,E-ACA+M-CTA,E-ACC+M-CTG共7对适合杜仲AFLP分析的引物组合。【结论】经重复验证,建立的AFLP反应体系适用于杜仲的AFLP分析。

番茄AFLP技术体系的优化与建立

以番茄为材料,通过对扩增长度多态性(AFLP)反应体系中的几个关键参数进行优化,建立了适合于番茄的AFLP分子标记体系。结果表明,用于反应的DNA采用CTAB法提取较好,酶切的基因组DNA以100 ng为宜,酶切-连接采用一步法,37℃条件下进行,反应时间为10 h,预扩增产物的稀释倍数以30倍为宜,采用优化好的体系,29对引物组合在两份供试材料均可扩增出稳定清晰的带纹60～100条。本研究为番茄的分子标记克隆及抗病育种的辅助选择提供了有力工具。

燕麦AFLP反应体系的建立与优化

在利用扩增片断长度多态性(AFLP)技术研究燕麦Avena sativa遗传多样性过程中,从引物筛选、酶切连接、扩增条件、检测方法等几个方面进行优化,建立燕麦AFLP最适反应体系为:800 ng/μL DNA用10U EcoRⅠ和4 U MseⅠ在37℃7 h,65℃4 h温浴双酶切;16℃下连接过夜;预扩增取连接产物1μL,10μmol/L预扩引物各0.6μL,10×buffer 2μL,dNTPS 2μL,ddH2O补平至20μL;取5μL稀释20倍后的预扩增产物,50 ng/μL EcoRⅠ、MseⅠ选扩引物各0.8μL,总体系20μL进行选择性扩增。在此优化体系下,可以得到重复性好、稳定且多态性高的燕麦AFLP条带。

白桦AFLP体系的建立及优化

以不同白桦个体为材料,通过琼脂糖凝胶电泳法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析了DNA提取、双酶切、连接、预扩增和选择性扩增过程中的各影响因素,建立了扩增酶切片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism)分析体系,并用E2+M4引物对不同白桦个体进行了扩增,得出优化的关键因素分别为:模板DNA的质量浓度为0.094g/L和0.086g/L,符合AFLP分析中的双酶切要求;酶切反应时间为2h15min;连接最适反应时间为2h;预扩增PCR的退火温度设为60℃。银染结果表明:扩增信号强,无背景干扰,条带清晰。

卷丹百合AFLP反应体系的建立与优化

以卷丹百合(Lilium lancifolium Thunb.)为试材,改良CTAB法提取DNA,通过对优化酶切、连接、预扩增、选择性扩增等试验条件筛选,初步建立适合卷丹百合的AFLP反应体系。结果表明,改良CTAB法提取的卷丹百合基因组DNA符合AFLP分析要求;最佳酶切时间为37℃酶切8 h;16℃连接过夜;预扩增产物稀释30倍为宜。利用该体系筛选出12对能获得稳定、清晰扩增图谱的引物组合,为卷丹百合遗传图谱构建及分子辅助育种奠定基础。

辣椒AFLP技术体系的建立与优化

以辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应的保持系21B为材料,通过对影响辣椒AFLP技术体系的若干关键因素,如提取DNA的方法、酶切与连接、预扩增和选择性扩增以及电泳和染色条件等的研究,建立了经优化的适合于辣椒的AFLP分子标记技术体系。采用该体系,对辣椒进行AFLP分析,能够得到清晰稳定的分子标记图谱,为今后利用AFLP技术进行辣椒细胞质雄性不育基因的定位奠定了技术基础。

银杏AFLP反应体系的建立及优化

以6个银杏种质为试材,通过对影响AFLP技术的多种因素进行研究,建立了一套适合银杏的AFLP技术优化体系。优化的关键因素为:①模板DNA的质量:经多次抽提纯化,将DNA沉淀挑出,而不采用离心方法,获得高纯度的DNA;②酶切时DNA模板为300 ng,反应时间为6 h;③连接最适反应时间为10 h;④预扩模板即连接产物最佳用量为1μl;⑤预扩增产物最适稀释倍数为70倍。

短蛸AFLP分子标记分析体系的优化与建立

本研究构建了短蛸扩增片段长度多态性(AFLP)分析体系,对DNA提取、双酶切反应、连接反应、预扩增反应、选择性扩增反应和银染等步骤进行了分析。得到了一种适于短蛸AFLP技术分析的优化体系,该体系中各优化因素为:模板DNA浓度为200 ng/μL;酶切体系中,MseI和EcoR I各加入5 units,缓冲液使用MseI buffer Tango,反应时间为3-4 h;连接最适反应时间为12 h;预扩增产物最适稀释倍数为20倍。该体系的构建为AFLP技术在短蛸分子遗传多样性研究中的应用奠定了基础。

割手密AFLP分子标记技术体系建立与优化

【目的】建立和优化割手密AFLP分子标记技术体系,为割手密遗传多样性分析、遗传图谱构建提供技术支持。【方法】以广西割手密GXS87-16、GXS85-30、GXS79-9、GXS96、GXS112、GXS212为材料,利用改良SDS法提取DNA,并用EcoRⅠ和MseⅠ酶切,连接接头后,采用正交试验设计对影响预扩增反应和选择性扩增反应的主要成分如Mg2+、模板DNA、引物、dNTP、Taq聚合酶浓度进行优化。【结果】样品DNA用限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ各3U于PCR仪过夜可完全酶切。经正交设计优化,较佳的预扩增体系包含0.4μLdNTPs(20mmol/mL),1.6μLMg2+(25mmol/mL),2.0μLEcoRⅠ-P(5pmol/mL),2.0μLMseⅠ-P(5pmol/mL),1UTaq酶(1U/μL),DNA模板稀释10倍;选择性扩增体系包含0.4μLdNTPs(20mmol/mL),0.8μLMg2+(25mmol/mL),1.0μLEcoRⅠ-AAG(6pmol/mL),1.0μLMseⅠ-CAG(6pmol/mL),3UTaq酶(1U/μL),DNA模板稀释20倍。以对优化反应体系扩增获得的PCR产物用5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染后,可获得清晰的多态性指纹图谱。【结论】建立的割手密AFLP分子标记技术体系具有扩增条带清晰、多态性丰富的特点,可为构建割手密高密度遗传图谱提供技术支持。

枣cDNA-AFLP技术体系建立与优化

建立了枣(Ziziphus jujuba Mill.)cDNA-AFLP分析的优化体系和反应程序。提取获得的总RNA以人工合成的Oligo(dT)18为引物,利用鼠源反转录酶(M-MLV RT)合成cDNA第1链,合成双链cDNA后用限制性内切酶EcoRⅠ(识别6个碱基位点)与MseⅠ(识别4个碱基位点)酶切,酶切连接后,使用与接头序列互补的预扩引物对cDNA片段池进行PCR扩增,扩增后的cDNA池定量至1 ng/μL,作为选择性扩增的模板,优化得到的选扩反应体系为:20μL的反应体系中含5μL模板,2μL 10×PCR buffer,2μL MgCl2(25 mmol/L),EcoRⅠ特异性引物(50 ng/μL)1μL,MseⅠ特异性引物(50 ng/μL)1μL,10 mmol/L dNTP0.4μL,5 UTaqDNAPolymer-ase 0.12μL。选扩程序:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,65℃退火30 s(每个循环降0.7℃),72℃延伸1 min,13个循环;94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,31个循环;72℃7 min。

南瓜AFLP反应体系的建立与优化

以印度南瓜矮生等基因系yd为材料,从叶片中提取基因组DNA,对酶切、连接、预扩、选扩反应体系及银染方法进行优化研究,建立高效稳定的南瓜AFLP反应体系,即反应体系为DNA模板量500 ng、37℃酶切5 h、连接3 h、预扩产物稀释50倍及Mg2+1.5 mmoL/L、dNTP 0.19 mmoL/L的效果最好。

哈尔滨产乙醇杆菌属AFLP反应体系的建立与优化

为建立和优化适合于哈尔滨产乙醇杆菌属基因组AFLP分析的技术体系,以哈尔滨产乙醇杆菌属Ethanoligenens harbinense为研究材料,对AFLP反应体系的几个关键参数进行探讨和优化.结果表明,20μL反应体系中,用于酶切的基因组DNA的纯度(OD260/OD280)和质量分别为1.8～1.9和50～100 ng之间为宜;限制性内切酶(EcoRI/MseI)组合的最佳酶切用量和酶切时间分别为EcoRI(2.0μL)/MseI(0.7μL)和3 h;琼脂糖凝胶电泳图谱对比显示,利用EcoRI-A/MseI-G、EcoRI-G/MseI-A、EcoRI-G/MseI-C、EcoRI-T/MseI-A、EcoRI-T/MseI-C、EcoRI-T/MseI-G和EcoRI-T/MseI-T 7个选择性扩增引物组合选扩出的条带稳定、清晰、无背景干扰,能够很好地反映哈尔滨产乙醇发酵细菌间DNA指纹图谱的多态性分布,为构建发酵产氢细菌AFLP图谱和种间遗传多样性奠定基础.

苦瓜外观性状AFLP反应体系的建立及优化

为探讨苦瓜性状遗传多样性奠定基础,通过对酶切方法的比较研究,建立并优化了苦瓜AFLP反应体系,采用TaqI/VspI或EcorI/MseI2种限制性内切酶酶切组合对的苦瓜(Momordica charantia.L.)的遗传多样性进行研究,探索适合其AFLP的双酶切体系。结果表明EcorI/MseI内切酶进行双酶切时酶切效果较好并且扩增出的条带带纹清晰,扩增信号强度基本一致符合研究需求,并初步筛选得到了32对清晰、多态性高的AFLP引物。说明最适宜的酶切方法是使用EcorI/MseI组合进行双酶切,通过重复试验证明了该体系稳定可靠,可用于苦瓜性状遗传多样性的分析。

美洲南瓜AFLP反应体系的优化与建立

以美洲南瓜(Cucurbita pepo L.)为试材,通过对AFLP反应体系中的关键因素进行研究,获得了稳定的南瓜AFLP反应体系。优化后的体系能扩增出稳定条带,可用于基因定位、南瓜遗传多样性分析、遗传图谱构建等研究,为南瓜分子辅助育种奠定了理论基础。

红花绿绒蒿AFLP反应体系的建立与优化

以红花绿绒蒿为试材,采用正交实验设计,研究了酶切时间、Mg^2+用量、dNTPS用量、模板DNA稀释倍数等对AFLP反应体系的影响,以期建立一个适合红花绿绒蒿的AFLP反应体系,并用优化后的体系对64对AFLP引物进行筛选。结果表明:通过所建立的AFLP反应体系能够获得清晰的条带,并利用该体系筛选出8对适合于红花绿绒蒿AFLP分析的引物组合。该研究可为今后AFLP标记在绿绒蒿属植物的遗传多样性分析及种质鉴定提供参考依据。

基于果蝇DNA甲基化的AFLP体系的建立及优化

以黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Canton-S品系为材料,采用改良SDS法提取高质量DNA,对连接、预扩增及选择性扩增进行分析,建立适用于果蝇基因组DNA甲基化多态性研究的AFLP优化体系:1)10μL连接体系加T4连接酶1 U,AluⅠ接头50 pmol,EcoR Ⅰ接头5 pmol,4℃反应12 h;2)25μL预扩增体系含Mg2+0.2 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,模板1.0μL,Taq DNA聚合酶2 U,E-00 50 ng,A-00 50 ng;3)25μL选择性扩增体系含Mg2+0.1 mmol/L,dNTPs 0.15 mmol/L,模板2.0μL,Taq DNA酶1.5 U、E+340 ng,A+3 40 ng.该体系稳定性高、重复性好,适用于果蝇基因组DNA甲基化多态性研究.

天门冬AFLP反应体系的建立及优化

为探讨天门冬种质间遗传多样性奠定基础,采用单因子试验,建立并优化了天门冬AFLP反应体系,研究酶的用量、酶切时间、预扩增体系和选择性扩增等对PCR扩增的影响。酶切反应体系加入5.0U EcoR I和Mse I于37℃保温3h;连接反应体系加入1.0U T4-DNA连接酶、2.0pmol Mse I接头和2.0pmol EcoR I接头,16℃保温过夜;选择性扩增反应体系加入1.0U Taq DNA聚合酶,0.4μL EcoR I和Mse I选择性引物;并筛选得到了8对清晰、多态性高的AFLP引物。17份天门冬种质对建立的AFLP反应体系检验,证明该体系稳定可靠,可用于天门冬种质多样性的分析。