以AFP升高为主要表现的成人Wilson病的临床和遗传学特征

目的探讨以AFP升高为主要表现的成人肝豆状核变性的临床和遗传学特点。方法收集患者的临床资料,采用外显子组捕获和测序患者的致病突变,并对突变前后的蛋白空间结构进行对比分析。结果患者为49岁的中年女性,临床表现为AFP升高,病理表现为肝脏脂肪变性的成人肝豆状核变性。基因分析结果显示ATP7B基因突变c.3316G>A和c.2333G>T的复合杂合子,蛋白结构预测分析显示突变c.2333G>T影响ATP7B蛋白在细胞内的定位和运输,是致病性突变。结论以AFP升高为主要表现的成人肝豆状核变性,青霉胺治疗效果确切。

暗纹东方鲀耐寒相关基因CIRBP、HMGB1和AFP-Ⅳ的分子特征和对低温胁迫的响应

为了探索暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)对低温环境的响应机制,克隆了暗纹东方鲀耐寒相关基因CIRBP、HMGB1和AFP-Ⅳ的cDNA序列,并进行了基因的分子特征和功能分析。组织分布检测显示CIRBP和HMGB1在下丘脑、肝脏和肌肉中具有高表达,而AFP-Ⅳ则主要在肝脏中表达。在受到低温胁迫后,3种基因在肝脏和下丘脑中的表达呈现不同的变化趋势,其中CIRBP基因在肝脏中于48h表达量显著增加,在下丘脑中于12h和48h有上调表达;HMGB1基因在肝脏中呈现逐渐上升的趋势,于48h达到最大值,而在下丘脑中呈现先上升后下降的趋势,处理后2h达到最大,2—8h下降,于8h下降至最低,随后恢复至初始水平;肝脏中的AFP-Ⅳ在0—24h无显著变化,在48h上升至最大值。进一步通过大肠杆菌原核表达系统研究了AFP-Ⅳ的抗冻功能,发现AFP-Ⅳ融合蛋白在–80℃下具有抗冻活性,并且抗冻活性随着浓度的增加而提高。研究结果表明3种基因都参与了暗纹东方鲀对低温胁迫的应答过程,为深入探索暗纹东方鲀的耐低温机制奠定了基础。

含AFP基因调控序列的pAFP-P53-EGFP质粒诱导AFP阳性肝癌细胞凋亡

目的:观察含AFP基因调控序列的载体对AFP阳性肝癌细胞的靶向致凋亡作用。方法:将AFP启动子、沉默子和远端增强子Ⅲ组合为1.2 kb的AFP基因调控序列,构建pAFP-EGFP载体,分别转染人肝癌HepG2(AFP阳性)、人肝癌SMMC7721(AFP阴性)和人宫颈癌HeLa(AFP阴性)细胞,荧光显微镜下观察EGFP荧光蛋白表达强度。引入P53基因片段,构建pAFP-P53-EGFP重组质粒,转染HepG2、SMMC7721和HeLa细胞,Western blotting检测各组细胞P53蛋白的表达,流式细胞术分析各组细胞凋亡率及细胞周期。结果:成功构建了pAFP-EGFP和pAFP-P53-EGFP重组质粒。pAFP-EGFP转染后,AFP阳性的HepG2细胞中EGFP荧光蛋白表达显著高于AFP阴性的SMMC7721和HeLa细胞。pAFP-P53-EGFP转染后,HepG2细胞中P53蛋白的表达量明显高于SMMC7721和HeLa细胞;HepG2细胞的G1期细胞及细胞凋亡率明显高于SMMC7721和HeLa细胞[(66.7±0.25)%vs(50.5±0.18)%,(51.0±0.20)%,P<0.05;(2.65±0.08)%vs(0.42±0.03)%,(0.39±0.02)%,P<0.05],但S期细胞明显低于转染后SMMC7721和HeLa细胞[(20.1±0.22)%vs(29.8±0.18)%,(37.8±0.21)%,P<0.05]。结论:含AFP基因调控序列的pAFP-P53-EGFP载体可专一性地作用于AFP阳性肝癌细胞,引起肝癌细胞周期阻滞和凋亡。

萝卜抗真菌蛋白基因Rs-AFPs在大肠杆菌中的表达及其转化番茄的研究

通过基因工程手段将萝卜抗真菌蛋白基因Rs AFP1( 2 ) 插入大肠杆菌表达载体pTrxFus中并诱导表达 ,其融合表达产物约 2 2kD ,约占总可溶蛋白的 0 .4 5 % (0 .5 % )。抑菌活性试验表明 :重组Rs AFP1( 2 ) 有抑菌活性 ,其中Rs AFP2 较Rs AFP1抑菌活性强。构建了Rs AFP2 基因的植物表达载体pBIAFP2 。利用农杆菌介导法将pBIAFP2 导入番茄中 ,并诱导出完整的植株 32株。对其中 2 8株进行PCR和PCR SouthernBlot检测 ,其中 17株呈阳性。对经PCR SouthernBlot检测呈阳性的植株进行SouthernBlot检测 ,6株呈阳性。

转美州拟鲽抗冻蛋白基因(AFP)番茄的叶片电导率测定

对转美州拟鲽抗冻蛋白基因（ADP）的第三代（D3）番茄及其对照，经低温处理后进行幼苗叶片组织电导率测定，发现转基因各组电导率均比对照明显降低，说明导入的AFP基因已经表达并使番茄获得抗寒性。

人肝细胞癌中AFP基因的表达

目的：探讨ＡＦＰｍＲＮＡ在人肝细胞癌中的表现规律。方法：用ＲＴ－ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ技术检测３０例肝癌组织及癌旁组织ＡＦＰｍＲＮＡ；放免法检测其血清ＡＦＰ。结果：２８例癌组织ＡＦＰｍＲＮＡ阳性（２８／３０），２例癌旁组织ＡＦＰｍＲＮＡ阳性；９例血清ＡＦＰ阴性者有７例癌组织ＡＦＰｍＲＮＡ阳性；２例癌组织ＡＦＰｍＲＮＡ及血清ＡＦＰ均阴性。结论：人肝细胞癌ＡＦＰ基因表达调控形式不同，ＡＦＰｍＲＮＡ在早期诊断肝细胞癌中有一定价值。

美洲拟鲽抗冻蛋白基因(afp)导入番茄的研究

将整合在Ｔｉ质粒上的ａｆｐ基因作为供体ＤＮＡ，用花粉管通道和子房注射方法导入番茄品种“中蔬四号”中，对Ｄ１、Ｄ２代进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交获得杂交带；田间抗寒性试验表明，在春季平均气温低于正常年份４·４℃条件下，转基因组植株生长势优于对照；致死温度也比对照降低２℃．

肝癌中Survivin表达与PCNA和AFP的关系及意义

目的 :探讨Survivin在原发性肝细胞癌 (HCC)组织中的表达及与PCNA和AFP的关系。方法 :采用Westernblot和RT -PCR检测 4 3例肝癌组织、2 0例癌旁组织和 11例正常肝组织中Survivin蛋白和mRNA的表达情况。免疫组化 (SP法 )检测Sur vivin、PCNA和AFP蛋白的表达情况。结果 :4 3例HCC标本中分别有 30例表达Survivin蛋白 (6 9.8% ) ,除 1例癌旁组织外 ,其它癌旁组织和正常肝组织中未见Survivin蛋白表达。Survivin表达与肝癌的病理分级、临床分期和AFP的表达等无明显相关。Survivin表达与肝癌细胞增殖活性 (PCNA -LI)显著相关 (P <0 .0 5 )。结论 :Survivin在肝癌组织中高表达 ,提示Survivin在肝癌的发生、发展过程中起重要作用 ;Survivin的表达与肝癌细胞增殖活性 (PCNA -LI)显著相关 。

AF0.3启动子调控的PNP/MeP-dR系统对AFP阳性肝癌细胞的特异杀伤作用

背景与目的:甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)启动子调控下的目的基因能在AFP阳性肝癌组织中特异性表达;嘌呤核苷磷酸化酶(Escherichiacolipurinenucleosidephosphorylase,PNP)/6-甲基嘌呤-2′-脱氧核糖核苷(6-methylpurine-2-deoxyriboside,MeP-dR)自杀基因系统具有强杀瘤效应。本研究旨在探讨AF0.3启动子调控下的PNP/MeP-dR系统对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤作用。方法:构建甲胎蛋白启动子AF0.3调控下PNP基因表达载体pAF0.3/PNP,导入AFP阳性肝癌细胞HepG2和阴性的肝癌细胞株SMMC7721,利用G418筛选获得稳定转染PNP基因的HepG2/0.3-PNP及SMMC7721/0.3-PNP细胞。RT-PCR检测二者在细胞中的表达。台盼蓝拒染法检测细胞增殖效应,MTT法和流式细胞仪检测两株细胞对MeP-dR的敏感性及旁观者效应,高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)检测PNP基因产物活性。结果:不论有氧还是缺氧条件,HepG2/0.3-PNP对MeP-dR均较为敏感,SMMC7721/0.3-PNP则对MeP-dR完全不敏感。在任何一种条件下,HepG2/AF0.3-PNP在混合细胞中比例达25%后,就可致明显旁观者效应;而在同样条件下,SMMC7721/0.3-PNP不导致明显的旁观者效应。HPLC结果显示,pAF0.3/PNP在HepG2细胞中可以将MeP-dR转化为6-MP,但其在SMMC7721中则不具有转化活性。结论:AF0.3启动子调控下的PNP/MeP-dR系统对AFP阳性HepG2细胞有较好的杀伤作用。

反义IGF-I基因转染人肝癌细胞分泌CEA和AFP水平的研究

本研究利用基因治疗方法中的反义RNA技术，通过脂质体包裹反义胰岛素样生长因子－I（IGF－I）基因导入人HepG2肝癌细胞株，NorthernBlot分析显示反义IGF－IRNA表达阳性。研究反义IGF－I基因转染的HePG2细胞分泌CEA和AFP的水平，放射性同位素的测定结果表明细胞培养上清中的CEA的水平显著地低于亲本细胞（P＜0．05），而分泌AFP的水平更显著地低于亲本细胞（P＜0．01）。预示着阳性克隆细胞的恶性程度低于亲本细胞，细胞内原有的生物学过程发生改变。

花粉管介导的转抗冻蛋白基因(AFP)水稻

低温和冷害在世界范围内广泛发生,对水稻的产量和品质造成严重影响。创造和培育具有强耐低温特性的水稻品种,对提高水稻产量具有重要的意义。本研究将从胡萝卜中克隆的抗冻蛋白基因(AFP)构建到植物表达载体pB I121(pB I121∶AFP)后,利用花粉管通道法将其转入籼稻品种NR158,获得了转基因后代。对T3代和T4代转基因植株的苗期耐冷性鉴定和PCR鉴定结果表明,部分转基因植株后代已经整合并且AFP基因得到了表达,获得了不同程度的耐低温性。

逆转录巢式PCR扩增AFP基因及肝癌诊断

［目的］探讨外周血甲胎蛋白（ＡＦＰ）基因分析对肝癌诊断的临床价值。［方法］从人肝癌组织和外周血单核细胞中制 备总ＲＮＡ，经随机引物和逆转录酶合成ｃＤＮＡ后，以巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ＡＦＰ基因片段，并分析其在肝癌诊断中的临床 应用价值。［结果］所设计ＲＴ－巢式ＰＣＲ扩增ＡＦＰ基因片段为 １５９ｂｐ，方法的灵敏度为５ｐｇ／ｍｌ。ＡＦＰ基因在肝癌、癌周和远癌组织中 的检出率分别为１００％、６５％和０；在肝癌患者外周血中的阳性率为５３．７％，明显高于其它肝病组和肝外肿瘤组（Ｐ＜０．０１）；在Ｉ、 Ⅱ和Ⅲ期肝癌中阳性率分别为３３．３％、２６．３％和７１．８％，伴肝外转移肝癌中全数阳性，与肿瘤大小无明显相关性。［结论］分析外 周血ＡＦＰ－ｍＲＮＡ有助于肝癌诊断。肝癌转移或术后复发的监测。

基因重组构建AFP mRNA的real time RT-PCR标准定量模板

目的 :构建AFPmRNA的realtimeRT PCR标准定量模板。方法 :提取肝瘤细胞株BEL740 2细胞总RNA ,进行RT PCR扩增并纯化AFP基因片段 ,与PMD 1 8T载体连接构建重组质粒。结果 :重组质粒的阳性克隆效率为81 .8% ,经酶切鉴定 ,目的基因片段已插入PMD 1 8T载体内。结论 :成功构建了AFPmRNA的标准定量模板 ,可应用于该基因的realtimeRT

抗冻蛋白基因AFP表达载体构建及转化紫花苜蓿初报

以胡萝卜基因组DNA为模板,用PCR方法扩增目的基因,连接到PGEM-T Easy Vector载体上,经XbalⅠ和SacⅠ双酶切,将目的片段连接到PBI121工程质粒上,通过农杆菌介导法转化和田苜蓿,为提高紫花苜蓿的抗冻性奠定基础。结果表明,成功克隆出抗冻蛋白基因AFP,并构建成AFP植物表达载体。获得了具有卡那霉素抗性的苜蓿愈伤组织,和田苜蓿愈伤组织的最佳Kan筛选浓度为60 mg/L。经PCR技术鉴定,AFP抗冻蛋白基因已整合到苜蓿基因组中。

含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒诱导HepG2细胞凋亡及相关机制研究

目的:探讨含有AFP启动子的携蜂毒素基因重组腺病毒诱导HepG2细胞凋亡的相关机制。方法:采用AnnexinV/PI双染法,流式细胞仪检测含rAFP的蜂毒素基因重组腺病毒(Ad-rAFP-Mel)感染HepG2细胞后的凋亡情况;采用罗丹明123、PI双染色法检测线粒体膜电位的变化,Fura-2染色检测细胞内Ca2+变化。结果:Ad-rAFP-Mel感染HepG2细胞后发生明显的细胞凋亡,线粒体膜电位下降,细胞内钙离子的浓度升高。结论:结果提示感染后表达的内源性蜂毒素可能通过影响线粒体、内质网等结构,从而诱导AFP阳性的肝癌细胞凋亡。

原位移植人肝癌裸鼠模型AFP基因的异常甲基化检测

【目的】研究原位异种移植肝癌模型AFP基因启动子区异常甲基化状态的检出状况,探讨其在肝癌发病机制研究中的应用。【方法】采用甲基化特异性PCR(MSP)和亚硫酸氢盐测序法(BSP),以人成纤维细胞基因组甲基化状态为正常对照,对10例原位移植人肝癌裸鼠模型肝癌组织中AFP基因启动子区甲基化状态进行分析和定位。【结果】10例模型肝癌组织中AFP基因启动子区甲基化状态均发生了不同程度的异常。【结论】原位移植人肝癌模型的肝癌组织中可以检测到AFP基因启动子区的去甲基化变化,MSP和BSP作为简便而有效的技术组合可以应用于基因甲基化状态的鉴定中。

纳米磁流体介导的重组质粒PEGFP-AFP-hTNFα对肝癌细胞HepG2的体外杀伤作用

目的探讨纳米磁流体作为肝癌基因治疗载体的可行性及AFP增强子能否使外来基因在AFP阳性细胞内高表达。方法构建重组质粒PEGFP-AFP-hTNFα并通过纳米磁流体分别转染入AFP表达阳性的肝癌细胞HepG2及AFP表达阴性的宫颈癌细胞Hela。转染12h后,于荧光显微镜下动态观察;48h后,RT-PCR和Westernblot分析HepG2细胞中hTNFα基因的表达情况,用MTT法检测HepG2细胞的存活,用流式细胞分析HepG2细胞的凋亡。结果纳米磁流体能将重组质粒PEGFP-AFP-hTNFα转入HepG2细胞,并且其转染效率高于脂质体;RT-PCR及Westernblot证明转染的HepG2细胞有hTNFα基因的表达;MTT及流式细胞分析说明hTNFα基因发挥杀伤细胞作用。结论纳米磁流体能将重组质粒PEGFP-AFP-hTNFα转染HepG2细胞并获得表达,可作为肝癌基因治疗的基因载体。采用AFP增强子可使目的基因在HepG2细胞中定向而特异性表达。

抗人AFP抗体噬菌体呈现文库的构建筛选及基因序列测定

从人ＡＦＰ免疫小鼠脾细胞ｍＲＮＡ中扩增出全套抗体Ｖ区基因并随机拼接为ＳｃＦｖ基因，构建全套ＳｃＦｖ基因噬菌体呈现文库，经两轮ｐａｎｎｉｎｇ筛选富集，一次从９４个单个重组噬菌体克隆中筛选到１４个具有ＡＦＰ结合活性的克隆，测定两个阳性克隆中ＳｃＦｖ基因的核苷酸序列，获得一个Ｖ＿Ｈ基因和两个Ｖ＿Ｋ基因，其基因序列分别与鼠ＩｇＶ＿ＨＪ５５８、Ｖ＿ｋ－ＯＸ１和Ｖ＿ｋ４／５家族同源性最高；推导出的氨基酸序列中均含有抗体Ｖ区特征性的两个恒定的半胱氨酸残基、具有明确的三个ＣＤＲ和四个ＦＲ序列，表明这三个基因均系新发现的功能性鼠抗体Ｖ区基因序列。

缺氧促进5HRE和AFPp调控的NTR/CB1954自杀基因系统特异杀伤HepG2细胞

目的:研究5拷贝缺氧反应元件(5HRE)和甲胎蛋白启动子(AFPp)联合调控的自杀基因系统硝基还原酶/CB1954(nitro-reductase/CB1954,NTR/CB1954)在缺氧环境下对人肝癌细胞株HepG2生长的抑制作用。方法:利用5HRE作为增强子和AFPp构成联合调控元件,与自杀基因NTR构成真核表达载体。将载体转染AFP阳性的人肝癌细胞株HepG2及AFP阴性的人胃癌细胞株MKN45,利用G418筛选稳定转染的细胞。用RT-PCR和Westernblotting检测NTR的表达。将前体药物CB1954加入稳定表达NTR基因的细胞,用MTT法观察其毒性代谢产物4-羟胺还原产物对肿瘤细胞生长的抑制作用。结果:成功筛选出稳定表达NTR的单克隆HepG2细胞和MKN45细胞。RT-PCR和Westernblotting证实单克隆HepG2细胞中NTR在mRNA和蛋白水平的表达,且缺氧环境中的表达量更高;单克隆MKN45细胞在常氧和缺氧环境中均无NTR表达。MTT法检测发现,缺氧环境下NTR基因能有效地活化前体药物CB1954,剂量依赖性地抑制NTR阳性的HepG2细胞的生长(P<0.05);但对MKN45细胞和野生型HepG2细胞无抑制作用。结论:5HRE和AFPp双重调控的NTR/CB1954自杀基因系统在体外缺氧环境下可促进对人肝癌细胞株HepG2靶向性杀伤作用。

原发性肝癌患者血清p16基因甲基化与AFP、CEA的分析

[目的]分析原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者血清中p16启动子区域甲基化的改变状况及其AFP、CEA临床意义的比较。[方法]运用甲基化特异性PCR技术,检测64例HCC患者血清p16基因启动子区域甲基化的改变情况,并分析与AFP、CEA敏感性、特异性的关系。[结果]HCC患者血清p16基因甲基化检出率为76.6%(49/64),而正常对照组和良性肝部疾病组血清未检出p16基因甲基化,AFP阳性检出率81.3%(52/64),CEA阳性检出率21.9%(14/64)。[结论]p16基因检出启动子区域异常甲基化是HCC辅助诊断的分子标志物之一,三者联合检测对肝癌诊断有实用价值。