非洲猪瘟病毒O174L蛋白的真核表达载体构建及分子特征分析

为分析非洲猪瘟病毒O174L基因,通过同源重组方式将O174L基因连接至p RK5M-C-2×Strep载体,构建重组质粒,经PCR扩增和测序鉴定正确后,将重组质粒转染至猪小肠上皮细胞系(porcine intestinal columnar epithelial cells,IPEC-J2)中,通过免疫荧光和Western blot检测O174L蛋白的表达情况。PCR及测序结果显示,p RK5M-C-2×Strep-O174L重组质粒构建成功。免疫荧光和Western blot检测结果显示,O174L蛋白能够在IPEC-J2细胞中稳定表达。生物信息学分析结果显示,基于O174L基因和B646L(p72)基因序列构建各分离毒株的2个系统发育树间排列高度相似。来自中国的16株分离株中,O174L基因序列的相似性高达96.76%~100.00%。其中,与中国爆发的其他Ⅱ型分离株相比,China/2018/Anhui XCGQ在O174L蛋白的第67、75及110位氨基酸存在差异,GZ201801在第110位氨基酸存在差异。Ⅰ型分离株SD/DY-I/2021和HeN/ZZ-P1/2021的O174L蛋白的氨基酸序列分别在第13、73、93、95、113和114位上与其他中国Ⅱ型分离株存在差异。O174L蛋白为稳定的亲水蛋白,没有信号肽和跨膜区;其二级结构由α螺旋、β折叠和无规则卷曲组成,三级结构预测结果与二级结构预测相符。以上结果为深入研究ASFV O174L蛋白与宿主间的相互作用和遗传进化提供了基础。

高血压肾损害患者IL-6-572、IL-6-174基因多态性及其与贝那普利治疗反应的相关性

目的探讨白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)-572、IL-6-174基因多态性与高血压肾损害及贝那普利治疗反应的相关性。方法入选284例初次诊断高血压病的患者,根据24h尿蛋白排泄率(urinary albumin excretion,UAER)水平分为高血压组(UAER<20μg/min)和高血压肾损害组(UAER≥20μg/min)。检测IL-6水平及IL-6-572、IL-6-174基因多态性。然后用贝那普利干预,观察具备IL-6-572、IL-6-174的不同基因型的患者的治疗反应。结果高血压肾损害组中,IL-6-572的CG基因型、IL-6-174的GG基因型比例最高。贝那普利治疗对具有IL-6-572GG基因型、IL-6-174CC基因型的高血压肾损害患者治疗效果最佳。结论IL-6-572、IL-6-174基因多态性与高血压肾损害及其对贝那普利治疗的反应相关。

噬菌体MS2和φX174的双层琼脂平板和液体培养基扩增方法的建立

噬菌体MS2和φX174曾广泛作为指示病毒,用来研究病毒在土柱和田间实验条件下的迁移行为。本文详细介绍了实验室小规模双层琼脂平板扩增和大规模高复数感染法制备纯噬菌体溶液的条件和方法步骤。宿主细菌E.coli(ATCC 15597)的最佳培养时间为90～120min,而E.coli(ATCC 13706)的最佳培养时间为120～150min,在上述时间段内,它们的生长分别进入对数期。小规模双层琼脂平板扩增方法耗时、耗力,但用高复数感染扩增方法可获取一次大量(约500ml)的高浓度纯噬菌体MS2和φX174溶液,它们的含量分别可达1011pfu/ml和108pfu/ml。

在大量同质异位素干扰下的同位素稀释质谱法测定^(173)Lu和^(174)Lu

当2种以上元素在热表面电离质谱计(TIMS)蒸发带表面蒸发时,蒸气中各元素的比例随着蒸发带加热电流的变化而变化,相应质量数处离子流的比值也随之发生变化。据此原理,建立了大量同质异位素干扰下的同位素分析方法。该方法的可靠性在同质异位素干扰量为1 000倍的情况下得到了实验验证。结合该方法和热表面电离同位素稀释质谱法(ID-TIMS)分析了大量173Yb和174Yb干扰下放射性核素173Lu和174Lu在溶液中的浓度,173Lu和174Lu合成标准不确定度分别为0.45%和1.1%。

食用型紫心甘薯新品种湘紫薯174的选育

湘紫薯174是以浙紫薯1号为母本、浙紫薯3号为父本杂交选育而成的食用型紫心甘薯新品种,薯块纺锤形,薯皮紫红色,薯肉紫色,结薯较集中整齐,单株结薯4~5个,大中薯率82.7%以上,熟食味好,抗黑斑病,中抗根腐病、茎线虫病和薯瘟病;每667 m^2鲜薯产量1913~2359 kg,薯干产量549~736 kg;花青素含量为714.5 mg·kg^-1(FW)。适宜在湖南、湖北、江西、江苏、浙江等地春夏薯区种植。

A-174改性丙烯酸酯乳液的合成及其性能研究

以丙烯酸酯类单体为原料,SE-10为乳化剂,过硫酸钾和亚硫酸氢钠为氧化还原引发体系,进行硅烷偶联剂改性丙烯酸酯乳液的合成及性能研究。在纯丙树脂骨架上引入有机硅氧烷单元,改善纯丙树脂的耐热性、耐水性等涂膜性能,制备了具有良好水分散性和综合性能优良的硅烷偶联剂改性的水性丙烯酸树脂。采用FT-IR分析产物结构,采用TG对产物的涂膜进行表征,分析了硅烷偶联剂对涂膜性能的影响。结果表明,当γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(A-174)的质量分数为丙烯酸树脂的2%时,改性丙烯酸酯乳液具有良好的分散性和储存稳定性,其固化涂膜的耐热性、耐水性和附着力有很大的改善。

T4、φχ174D和f2三种噬菌体对戊二醛消毒剂抵抗力的比较研究

目的筛选出消毒实验中评价消毒因子对病毒灭活效果的指示噬菌体。方法比较研究噬菌体T4、φχ174D和f2对戊二醛消毒剂的抵抗力。消毒剂对噬菌体的灭活效果采用悬液定量灭活试验、中和剂鉴定试验、噬菌体的检测采用双层琼脂法。结果13000mg/L的戊二醛对噬菌体T4作用20min,或6000mg/L的戊二醛对噬菌体T4作用5min即可达到消毒水平(对噬菌体T4的灭活对数值(LIV)或噬菌体T4的对数减少值〔LRV)(log10No-log10Nt)≥4.00log10〕;22500mg/L的戊二醛对噬菌体φχ174D作用20min,或5000mg/L的戊二醛对噬菌体φχ174D作用5min达到消毒水平;34000mg/L的戊二醛对噬菌体f2作用40min,或8000mg/L的戊二醛对噬菌体f2作用10min达到消毒水平。结论上述三种噬菌体对戊二醛的抵抗力由强到弱为:噬菌体f2>噬菌体T4>噬菌体φχ174D。

三氧化二砷对人大肠癌ls174细胞凋亡及相关耐药蛋白基因表达的影响

目的:探讨三氧化二砷(As2O3)对人大肠癌ls174细胞相关耐药蛋白基因表达的影响。方法:确定三氧化二砷(As2O3)对人大肠癌ls174细胞的非细胞毒剂量,分别采用生化方法及RT-PCR方法检测非细胞毒剂量下As2O3对人大肠癌ls174细胞MRP、GST-π、TOPO-Ⅱ表达水平的变化。结果:As2O3的非细胞毒性剂量(生长率>95%)为4.0μg/ml。以此为逆转耐药剂量可使人大肠癌ls174细胞,MRP、GST-π、TOPO-ⅡmRNA表达水平下调。结论:As2O3可部分逆转人大肠癌ls174细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性,MRP、GST-π、TOPO-Ⅱ改变参与人大肠癌耐药机制。

Doxycycline抑制大肠癌LS174T细胞侵袭的体外实验研究

目的:观察多西环素(Doxycycline)在体外对LS174T侵袭能力的抑制作用,并尝试探讨该抑制作用的分子机制。方法:1)MTT法观察Doxycycline对LS174T细胞粘附力的影响;Transwell小室法检测不同浓度Doxycycline对细胞侵袭和运动能力的抑制作用;2)RT-PCR法检测不同浓度Doxycycline作用48h后,MMP2的mRNA表达情况,同时明胶酶谱法检测MMP2分泌。结果:1)Doxycycline能够以剂量依赖方式抑制大肠癌LS174T细胞的体外运动和侵袭能力,但不影响其粘附能力;2)Doxycycline能够抑制LS174T细胞MMP2的mRNA表达。结论:Doxycycline在体外能够有效地抑制大肠癌LS174T细胞的侵袭、转移,其中MMP2是抑制大肠癌细胞LS174T的一个有效靶点。

Ascl2 RNA干扰对结肠癌LS174T细胞EMT相关microRNA表达的影响

目的探讨转录因子Ascl2对结肠癌细胞上皮间质转化(EMT)相关的微小RNA(microRNA)的影响。方法对结肠癌LS174T细胞进行Ascl2的RNA干扰质粒转染,对照质粒shRNA-control/EGFP和干扰质粒shRNA-Ascl2/EGFP转染LS174T细胞,经G418筛选建立了稳定转染的细胞系,并分别命名为shRNA-Ctr/LS174T和shRNA-Ascl2/LS174T细胞,实时荧光定量PCR(real-time PCR)和蛋白印迹(Western-blot)实验确定干扰效果后,采用Transwell小室侵袭实验观察Ascl2干扰对细胞侵袭能力的影响,再进一步行microRNA芯片筛选与EMT相关的microRNA并行real-time PCR验证。结果干扰后细胞中Ascl2的mRNA和蛋白质表达均明显减少(P<0.01)。Ascl2干扰后LS174T细胞的侵袭能力明显下降(P<0.01)。microRNA芯片筛选出与EMT相关的microRNA-200家族(包括microRNA-200b、microRNA-200a、microRNA-429、microRNA-200c、microRNA-141)在Ascl2干扰后均出现2倍以上的上调(P<0.01)。结论 Ascl2可能通过转录调节microR-200家族,进而调控EMT从而影响结肠癌的浸润转移。

藤龙补中汤对结肠癌细胞LS174T增殖和凋亡的影响

目的:观察藤龙补中汤对结肠癌细胞LS174T增殖和凋亡的影响。方法:用不同浓度藤龙补中汤处理人结肠癌细胞LS174T和人结肠上皮细胞CRL-1790。用细胞计数检测试剂盒检测细胞增殖,平板法检测细胞克隆形成数目并计算抑制率,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,比色法检测细胞中半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3(caspase-3)、caspase-8和caspase-9的活性。结果:与对照组比较,藤龙补中汤对人结肠上皮细胞CRL-1790增殖无明显影响;1mg/mL藤龙补中汤作用72h,2mg/mL藤龙补中汤作用48、72h,5～20mg/mL藤龙补中汤作用24～72h均可显著抑制LS174T细胞增殖;1～20mg/mL藤龙补中汤可显著抑制LS174T细胞克隆形成;5～20mg/mL藤龙补中汤可诱导LS174T细胞凋亡,使LS174T细胞阻滞在G0/G1期,增强LS174T细胞caspase-3、caspase-8和caspase-9活性。结论:藤龙补中汤可抑制结肠癌LS174T细胞增殖,阻滞LS174T细胞于G0/G1期,促进LS174T细胞凋亡;藤龙补中汤促LS174T细胞凋亡作用可能与增加caspase-3、caspase-8、caspase-9活性相关。

血管紧张素原基因T174M和M235T多态与原发性高血压的关系

目的 研究血管紧张素原 (AGT)基因第 2号外显子T174M和M 2 35T多态与中国汉人原发性高血压 (EH)的关系。方法 采用多重SNaPshot反应 ,在 185例EH患者 (EH组 )和 185名健康对照者 (对照组 )中 ,对T174M和M 2 35T多态进行基因分型。结果 对照组与EH组T174M和M2 35T多态的CC、CT和TT基因型分布的差异无显著性 (P值均 >0 .0 5 ) ;C、T等位基因频率的差异亦无显著性 (P值均 >0 .0 5 )。按性别进行分层 ,EH组女性的M 2 35T多态的基因型分布 (5 3、2 8、2 )与对照组女性 (37、11、6 )的差异有显著性 (χ2 =6 .4 0 3,P =0 .0 4 1)。Logistic回归分析显示 ,年龄 (β =0 .36 6 ,OR =1.4 4 2 ,95 %CI =0 .988～ 2 .10 4 ,P =0 .0 5 8)、体重指数(β =0 .2 11,OR =1.2 34,95 %CI=1.0 78～ 1.4 14 ,P =0 .0 0 2 )、三酰甘油 (β =1.70 5 ,OR =5 .5 0 1,95 %CI =2 .179～ 13.890 ,P =0 .0 0 0 )和血糖 (β =0 .74 5 ,OR =2 .10 6 ,95 %CI =1.0 4 0～ 4 .2 6 4 ,P =0 .0 39)均是EH发生的独立危险因素。结论 AGT基因M 2

IL-6基因调控区-174G/C多态性与急性脑梗死的关系

目的 探讨急性脑梗死患者 IL - 6基因调控区 - 174位点多态性与疾病的相关关系。方法 急性脑梗死患者 42例 ,男 2 4例 ,女 18例 ,年龄 41～ 90岁 ,平均 6 6 .6± 9.8岁。健康对照组 18例 ,男 11例 ,女 7例 ,年龄 31～ 5 4岁 ,平均 45 .6± 8.7岁。采用 PCR扩增、限制性内切酶片段长度多态性 ( RFL P)分析和 DNA序列测定 ,认识IL - 6基因调控区 - 174位点的多态性 ;同时 EL ISA定量分析脑梗死患者和正常人血清白细胞介素 - 6的含量。结果 急性脑梗死患者 IL - 6基因调控区 - 174位点均为 GG型。患者血清白细胞介素 - 6水平升高 ,明显高与正常对照组 ( P<0 .0 1)。结论 急性脑梗死患者未发现 IL - 6基因调控区 - 174位点的基因变异 ,推测 - 174位点的多态性没有参与急性脑梗死的发生和发展过程。

血管紧张素原基因T174M和M235T多态与脑梗塞的关系

目的 研究血管紧张素原(AGT)基因第2号外显子T174M和M235T多态与中国汉人脑梗塞发病的关系。方法 采用多重SNaPshot反应,在90例脑梗塞患者和90名健康对照者中,对T174M和M235T多态进行基因分型。结果 T174M多态基因型在脑梗塞组和对照组之间有差异,但未达到统计学意义(P=0.071);T、C等位基因频率与对照组相比有显著性差异(P=0.045)。M235T多态基因型在脑梗塞组和对照组中无显著性差异(P=0.194);脑梗塞组的C等位基因频率高于对照组,但未达到统计学意义(P=O.057)。在男性脑梗塞患者中,M235T多态基因型和等位基因频率与对照组相比均有显著性差异(P=0.030,P=0.011)。结论 AGT基因T174M多态可能与汉族整体人群脑梗塞的发病相关,而M235T多态可能只与男性脑梗塞的发病相关。

人结肠癌LS174T/5-Fu多药耐药细胞系的建立

目的建立人结肠癌多药耐药细胞系,并研究其生物学特性。方法以5-氟尿嘧啶(5-Fu)为诱导药物,LS174T细胞株为研究对象,利用浓度递增诱导法,建立LS174T/5-Fu多药耐药细胞系。MTT法测定药物敏感性,光镜、细胞计数法、流式细胞仪及RT-PCR等方法观察其生物学特征及多药耐药相关基因(MRP)mRNA表达。结果历时6个月成功建立人结肠癌多药耐药细胞系LS174T/5-Fu,对5-Fu耐药指数为40.24,且与羟基喜树碱、顺铂、依托泊苷和脱氧氟尿苷等多种化疗药物有不同程度的交叉耐药性;细胞形态发生改变;倍增时间较亲代细胞延长;细胞周期发现其G1和S期细胞增加,G2期细胞减少;MRP mRNA表达增高。结论LS174T/5-Fu细胞是一种可靠的人结肠癌多药耐药细胞系,该细胞系的建立为深入研究5-Fu诱导人结肠癌多药耐药的发生机制奠定了基础。

SIV感染CEM×174细胞后CD28家族免疫调控分子mRNA的动态变化

目的观察猴免疫缺陷病毒(SIV)感染CEM×174细胞后CD28家族免疫调控分子CD28、BTLA、ICOS、PD-1 mRNA表达水平的动态变化。方法以SIVmac251感染接种CEM×174细胞,收集感染后12,24,48,72,96,120,144,168,216h共8个时间点及正常未感染细胞,提取细胞RNA,以染料法逆转录荧光定量PCR法检测SIV、CD28、ICOS、PD-1、BTLA mRNA的表达。结果SIV mRNA在48h时表达即显著升高(P<0.05),随着SIV mRNA量的逐渐上升,ICOS在48h时开始显著升高(P<0.05),而CD28、PD-1 mRNA在120h时才出现表达显著增加(P<0.05);BTLA mRNA则呈现下降趋势,并在168h开始出现显著下调(P<0.05)。结论除BTLA以外,所检测SIV感染后细胞中促进免疫激活和抑制免疫的免疫调节因子(ICOS、PD-1、CD28)表达均显著升高,提示AIDS中存在免疫紊乱。

鳙小卫星pBC174的序列结构特性分析

用双脱氧DNA测序法对鳙 (Aristichthysnobilis)小卫星 pBC174进行序列测定。其长度为 1873bp。在这段序列中 ,A T含量高达 6 4 % ,从 15 11碱基处开始 ,含有多聚腺嘌呤 多聚胞嘧啶 ,即 (AC) 13 的短重复序列的隐蔽微卫星。序列中含有 2 0种限制性内切酶的 5 7个酶切位点 ,97个不同的正向重复序列 ,其中 71个 8bp、10个 9bp、10个 10bp、2个 11bp和 4个 17bp。根据序列分析 ,认为小卫星 pBC174是由富含A的重复序列TAAAGAAA和富含T的重复序列TTTTTACA等 2个不同的核心序列组成。

伍用TRH与ICI174，864对兔失血性休克心功能的影响

采用脑室给药方法研究了促甲状腺素释放激素（ＴＲＨ）与δ－阿片受体特异性拮抗剂ＩＣＩ１７４，８６４合用对失血性休克兔心功能指标的影响，旨在探讨ＴＲＨ与ＩＣＩ１７４，８６４是否可配伍用药治疗休克。ＴＲＨ、ＩＣＩ１７４，８６４两药单用剂量各为５０μｇ，合用剂量各２５μｇ。结果显示，两药半量合用改善失血性休克兔心血管功能作用不仅可达单药５０μｇ的效果，且较单用效果更佳。表明两药可配伍用药治疗失血性休克，且有一定的协同作用。

青蒿素类药物对结肠腺癌细胞LS174T的细胞毒作用

目的考察青蒿素(ART)、双氢青蒿素(DHA)及蒿甲醚(AM)对结肠腺癌细胞LS174T增殖的影响,为建立青蒿素类药物自身诱导代谢机制的体外研究体系奠定基础。方法采用噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度药物、分别作用不同时间后对细胞增殖的抑制情况,计算抑制率并求得半数抑制浓度(IC50)。结果抑制率均随药物浓度的增大和时间的延长而增加,ART作用24、48、72 h对LS174T的IC50分别为>240.00μmol/L、>240.00μmol/L、211.18μmol/L,DHA对LS174T的IC50分别为91.46、80.45、45.60μmol/L,AM对LS174T的IC50分别为>320.00、262.90、163.93μmol/L。结论 3种药物对LS174T增殖的抑制程度不同,但均呈浓度依赖性和时间依赖性。

L-精氨酸经一氧化氮途径对人结肠癌细胞株LS174的作用及其机制

目的探讨L-精氨酸(L-Arg)经一氧化氮途径对人结肠癌细胞株LS174的作用及其机制。方法LS174细胞在不同浓度L-Arg干预后,采用MTT法检测细胞增殖活性;光镜和电子显微镜观察细胞形态和结构的变化;AnnexinV/PI标记染色测定凋亡细胞;Western blotting和免疫细胞化学染色SP法检测VEGF、COX-2、p53、bcl-2和bax的表达。结果低浓度(0.125mmol/L)L-Arg对LS174细胞的生长有促进作用,高浓度(0.5、2、8、32mmol/L)L-Arg对LS174细胞的生长有抑制作用;在高浓度L-Arg组作用48h后引起了细胞核和细胞质一系列超微结构改变,电子显微镜可见LS174出现细胞缩小、染色质边集、固缩等细胞凋亡的形态改变;对照组凋亡细胞百分比为2.84%,低浓度L-Arg组凋亡细胞百分比为2.29%,随着L-Arg浓度增加,凋亡细胞百分比增加明显,分别为26.88%、28.95%、63.36%、84.51%;VEGF和COX-2在低浓度L-Arg组表达较对照组有增加趋势;p53和bcl-2在高浓度L-Arg组表达较对照组有明显降低趋势;bax在高浓度L-Arg组表达较对照组有明显增加趋势。结论低浓度L-Arg对LS174细胞的生长有促进作用,高浓度L-Arg对LS174细胞的生长有抑制作用;低浓度的L-Arg对LS174细胞的生长有促进作用的机制可能是在L-Arg代谢产物NO作用下,与上调VEGF与COX-2蛋白有关;高浓度的L-Arg对LS174细胞的生长有抑制作用的机制可能是在L-Arg代谢产物NO作用下,诱导肿瘤细胞凋亡;L-Arg诱导凋亡的机制与上调bax蛋白表达及下调p53和bcl-2蛋白表达有关。