向日葵AGO和DCL基因家族的鉴定和表达分析

为了解向日葵(Helianthus annuus)的Argonaute(AGO)和Dicer-like(DCL)的功能,利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AGO和DCL基因序列在向日葵基因组数据库中进行同源比对,对向日葵AGO和DCL家族成员进行生物信息学分析。结果表明,从向日葵中鉴定到15个HaAGOs和5个HaDCLs家族成员;这2类基因在染色体上的分布均不均匀。系统发育分析表明,与拟南芥相似,HaAGO家族成员可分为3个分支,HaDCL可分为4个分支;所有的HaAGO都具有保守的N domain、DUF1785、PAZ和PIWI结构域,HaDCL家族成员都含有PAZ和RIBOc结构域。表达分析表明,HaDCL3a和HaDCL3b在茎和花序中高度表达;亚细胞定位表明HaAGO多定位于细胞核。这表明向日葵中可能存在典型的RNAi干扰机制,并可能参与了协调向日葵的生长发育过程。

玉米AGO基因的克隆与表达分析

以玉米自交系‘昌7-2’三叶期前后2个时间点(种子萌发后5d和8d)幼苗不同组织部位的总RNA为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术,对玉米中6个Argonaute(AGO)蛋白家族基因(AGO1、AGO2、AGO4、AGO5、AGO7和AGO10)在幼苗不同发育时期及不同组织部位的表达谱进行了研究。结果表明:(1)AGO1、AGO2、AGO4和AGO7在种子萌发后5d和8d幼苗不同组织中均有表达,种子萌发后5d幼苗中的平均表达量均高于萌发8d的幼苗,且在地上部分新生组织或细胞分裂比较旺盛的组织中表达较多,表明AGO1、AGO2、AGO4和AGO7可能在玉米幼苗发育早期的分生组织分裂生长中发挥调控作用。(2)AGO5和AGO10只在叶片和茎尖中表达,其他组织中不表达;其中AGO5主要集中在新生叶和种子萌发后8d的茎尖中,AGO10在玉米叶发育过程中可能存在着迁移的现象。

青稞新基因HvMEL1 AGO的克隆和条纹病胁迫下的表达

为筛选与青稞条纹病相关的AGO类基因,本研究以青稞抗病品种昆仑14号和感病品种1141为材料,从感病和正常叶片的转录组测序结果中获得一个差异表达的AGO家族新基因,克隆验证了该基因为青稞HvMEL1 AGO。HvMEL1 AGO基因全长3462 bp,其中蛋白质编码区(CDS,coding domain sequence)在昆仑14号和1141品种中的一致性为100%,无内含子,全长3161 bp,包含一个3129 bp开放阅读框,编码1043个氨基酸,理论等电点为9.33,预测蛋白分子量为115,865.58 Da。蛋白质序列分析表明,HvMEL1 AGO为亲水性的不稳定酸性蛋白,具有高度保守的DUF1785、PAZ和PIWI结构域,属于AGO基因家族成员。进化树分析表明,HvMEL1 AGO与大麦AGO家族中HvAGO12、HvAGO18、HvAGO1D、HvAGO1B在拟南芥AGO家族系统发育树上属于AGO1一类;与HvAGO12的亲缘关系最近。蛋白质互作预测结果表明,在水稻中与MEL1作用密切的已知蛋白为DCL类,分别为DCL1、DCL2A、DCL3A、DCL3B和DCL4。半定量和定量PCR结果表明,条纹病胁迫下,抗病品种昆仑14号与感病品种1141的HvMEL1 AGO基因表达量显著下降;且1141显著高于昆仑14号(P<0.01)。推测青稞HvMEL1 AGO基因在青稞抗条纹病过程中发挥重要作用。本研究为探索HvMEL1 AGO基因在青稞抗条纹病过程中的作用及调控机制奠定基础。

巨桉AGO基因家族的生物信息学分析

为了解巨桉（Eucalyptus grandis）中Argonaute （AGO）的功能,经全基因组序列分析,巨桉中存在14 个AGO 基因家族成员,基因长度为2676-3225 bp,编码的蛋白质具有保守的Piwi、PAZ、DUF1785 结构域.巨桉EgrAGOs 基因可分为3 组,内含子和外显子结构具有明显的组织特异性.组内成员核苷酸序列和氨基酸序列保守性较高,同源性分别达到88.14% 和82.97%.EgrAGO 基因分布于第2、4、7、8、10、11 条染色体上,在进化过程中存在着串联复制和大片段基因复制机制.预测巨桉的大部分AGO 蛋白定位于细胞核和胞质中,表现出偏碱性和亲水性,具有较高的脂溶指数.基因表达分析表明,桉树EgrAGO成员在不同组织中的表达有明显差异,与木材形成相关的组织/ 器官中有较高的表达.这些为深入研究EgrAGO 基因的功能奠定了基础.

胃癌组织和肿瘤细胞系中AGO基因突变和表达的研究

目的 :筛查胃癌组织中AGO基因突变 ,检测不同肿瘤细胞系中AGO基因的表达情况。方法 :采用聚合酶链反应及变性高效液相色谱法 ,对 2 2例胃癌组织标本中AGO基因 β型全部外显子进行突变筛查 ;应用逆转录 聚合酶链反应法检测多种不同肿瘤细胞系中AGO基因α和 β型转录本的表达情况。 结果 :在所检全部胃癌组织中均未见AGO基因突变 ;AGO基因α和 β型转录本在所有不同肿瘤细胞系中均有不同程度的表达。结论 :AGO基因可能与胃癌的发生和发展无关 ,AGO基因表达缺失在肿瘤细胞中少见。

毛果杨AGO基因家族生物信息学分析

Argonautes(AGOs)蛋白是生物有机体中普遍存在的一类比较保守的蛋白质,在不同物种的RNAi及相关的途径中具有十分重要的功能,也调控着模式植物拟南芥的生长发育过程。该研究利用AGO蛋白的保守域在毛果杨基因组中进行同源比对,鉴定出毛果杨AGO基因家族成员13个,并对其成员进行了理化性质分析、motif结构比对、进化树构建、基因表达分析等。结果表明:毛果杨AGO基因家族成员基因长度为2463～3189bp,编码的蛋白质具有保守的Piwi、PAZ、DUF1785结构域。PtAGO基因分布于第1、6、8、9、10、12、14、15、16条染色体上,存在着串联重复序列。AGO蛋白定位于叶绿体、细胞核和胞质中,偏碱性和亲水性,具有较高的脂溶指数、不稳定性。基因组织表达分析表明,毛果杨PtAGO成员在不同组织中的表达有明显差异,在与木材形成相关的组织、器官中有较高的表达。

RNA干涉家蚕细胞Ago蛋白家族基因的表达研究

分别构建RNAi(RNA interference,RNAi)载体干扰家蚕细胞BmN中Argonaute1(Ago1)和Argonaute2(Ago2)基因的表达。首先利用PFBDM和pBac[A3-EGFPafm]载体构建Ago1和Ago2基因的RNA干涉载体,通过转染家蚕细胞发现,Ago1和Ago2基因表达明显下降。并观察细胞形态发现,转染RNAi载体96h后,家蚕BmN细胞逐渐失去正常的梭形状态,体积变大,形态变圆。该研究为进一步研究家蚕中small RNA的产生及作用机制提供了较好的基础。

家蚕AGO1蛋白结合RNA的分离与鉴定

RNA诱导的基因沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)核心蛋白为Argonaute(AGO)家族蛋白,作为miRNA及RNAi功能途径中的关键蛋白,能够结合miRNA和siRNA,降解靶标基因mRNA或抑制其翻译。因此,利用AGO蛋白抗体通过免疫沉淀分离其结合RNA是目前规模化分离鉴定miRNA及相关小RNA靶基因的重要方法。首先对家蚕AGO1基因进行克隆表达和抗体制备,用自制的兔多克隆抗体免疫沉淀家蚕组织内源BmAGO1蛋白,成功分离BmAGO1蛋白结合的RNA;同时在BmN细胞中采用6×His标签融合表达BmAGO1蛋白,用His单抗免疫沉淀His-BmAGO1蛋白,同样成功分离获得其结合RNA。qRT-PCR检测发现,BmAGO1蛋白结合的RNA中含有家蚕miRNA靶基因BmEm4的mRNA。研究结果为批量鉴定家蚕miRNA靶基因奠定了基础,同时也为深入研究BmAGO1蛋白在家蚕中的功能提供了依据。

玉米AGO基因在籽粒发育过程中的表达分析

以玉米自交系‘昌7-2’授粉后4个时间点(授粉后7、10、14和20d)的籽粒总RNA为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术,对玉米中5个Argonaute(AGO)蛋白家族基因(AGO1、AGO2、AGO4、AGO10和AGO18)在籽粒不同发育时期的表达谱进行了研究。结果表明:AGO1和AGO2在籽粒发育过程中呈现一致的表达趋势,在授粉后7d的籽粒中表达量最高,从授粉后7d到20d呈持续下降的趋势。AGO4、AGO10和AGO18具有一致的表达趋势,均呈现先下降后上升的趋势,在授粉后10d的籽粒中表达量最低。结合实验室前期获得的miRNA在玉米籽粒不同发育阶段的表达谱,发现不同AGO家族基因可协助其靶标miRNA参与玉米籽粒发育调控。

雷蒙德氏棉Argonaute基因家族的生物信息学预测与分析

Argonaute(AGO)蛋白是参与小RNA调控通路的重要元件,在生命体的生长发育过程中发挥着重要作用。本研究利用AGO蛋白的保守域在雷蒙德氏棉基因组中进行同源比对,鉴定出15个成员,并对其进行进化关系、染色体定位、基因结构、保守域、时空表达模式等分析。结果表明:该家族成员基因长度从3335到9086bp不等,其中11个基因被定位到7条染色体上;该家族成员可分为3个亚族,包含5个小组,各亚族内、小组间成员也存在很高的保守性;发现每个基因都有不同的时空表达模式,且各小组内成员之间存在协同和互补2种表达模式,找到在花器官特异表达的基因1个,胚珠中特异表达的基因3个。本文首次对棉花中AGO基因家族进行了鉴定和生物信息学分析,为进一步研究AGO基因家族在棉花中的功能奠定了基础。

基因编辑技术最新研究进展

基因编辑是一种对基因组及其转录产物进行定点修饰、定向敲除或插入目的基因的基因编辑技术。近年来,基因编辑技术发展日新月异,不仅极大的推动了基因功能研究进程,同时为人类遗传疾病的治疗带来了曙光。综述了CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、Ago/g DNA和SGN等技术的作用原理、优缺点、应用等,以期为相关领域的研究提供参考。

DNA干扰现象及其作用机理研究进展

与体内某一基因相同的DNA序列可特异性抑制细胞内靶标基因的表达,这种现象称之为DNA干扰(DNAi)。DNAi是随着转录后基因沉默现象而在烟草属植物上被发现,之后在一些动植物及其细胞上也被发现。在原核生物中也存在DNAi现象,且原核生物的Ago在体外也能实现DNAi。原核生物DNAi的机理主要是Ago以DNA为向导切割DNA或RNA,而真核生物可能是基因转录后抑制、基因组甲基化和启动子结合的转录抑制等。本文还对DNAi的进一步研究和应用进行了讨论和展望。

棉花AGO蛋白家族基因鉴定及表达分析

AGO蛋白在所有由小RNA介导的RNA沉默通路中发挥重要作用。在植物中,它广泛参与维持基因组的稳定、调控组织的发育、对逆境的应答以及对入侵的转基因和植物病毒的免疫。对AGO基因家族成员的研究有利于研究其功能。为揭示棉花中AGO家族的功能,本研究利用全基因组信息在陆地棉基因组中鉴定了27个AGO蛋白,并对这些家族成员的特性进行了进化分析,这些AGO蛋白被分为3类,蛋白长度介于731~1462 aa之间,第一、三亚家族蛋白编码区较多,第二亚家族蛋白编码区较少。27个基因分布在16条染色体上。8个基因在所有组织中的表达量较高,棉花AGO基因与拟南芥AGO基因在组织中的表达模式极为相似。本研究为进一步研究棉花中AGO蛋白的功能提供了指导意义。

AGO在非编码RNA功能中的作用

AGO(argonaute)蛋白家族存在于几乎所有的物种中,是一种高度保守的碱性蛋白。AGO蛋白在细胞整个生命进程中发挥重要角色,参与m RNA降解、基因沉默、蛋白翻译等多种细胞进程。AGO蛋白也可与不同的非编码RNA结合发挥重要的作用。研究非编码RNA基因的作用机制,有助于发现新的与器官形成、胚胎发育和生长相关的调控因子,进一步探究人类疾病发病机制,为开发新的治疗各种疾病的手段提供理论基础。该文主要对AGO在非编码RNA中的生物学作用加以综述。

橡胶树Ago蛋白基因家族分析

Ago蛋白基因家族成员与不同的小RNA结合,广泛参与细胞的生长发育及抵抗外源DNA的入侵。对Ago蛋白基因家族成员的研究有利于进一步了解各成员的功能,同时有助研究小RNA的功能。橡胶树的Ago蛋白基因家族及小RNA的研究均较少,为了弄清楚橡胶树Ago蛋白基因家族成员情况及其初步功能,本研究对橡胶树(Hevea brasiliensis)所有蛋白质序列进行了分析。用HMMER及BLAST等软件分析发现橡胶树有18个Ago蛋白,这些Ago蛋白进行分类及理化性质分析,发现其可分为3类,大多数Ago蛋白定位于细胞核,蛋白序列长度在577 aa至1 237 aa氨基酸之间,等电点在8.66至9.47间。通过qPCR技术研究橡胶树Ago蛋白的表达,发现18个Ago蛋白在不同叶龄间有差异,在白粉病菌对橡胶树进行感染处理后各Ago蛋白的表达也有差异,说明不同的Ago蛋白参与了不同的生理过程。这些结果为进一步研究各Ago蛋白在橡胶树的生长发育及抗病抗逆过程中的功能提供了理论依据。

小果野蕉家族蛋白序列特征分析和在根际促生菌作用下的表达分析

在真核生物中,Argonaute(AGO)蛋白是基于s RNA的基因沉默通路的效应蛋白,参与基因表达调控、DNA甲基化等分子过程,从而使植物的生长发育有条不紊的进行。同时,根际促生菌对植物生长有促进作用。本研究对小果野蕉的AGO蛋白进行比对鉴定,最终找到16个AGO蛋白,其中14个定位于6条已知染色体上。本研究还对蛋白结构和基因进化等问题以及这些基因对根际促生菌的响应进行了研究。研究发现:这些蛋白可分为4个亚家族,且AGO1亚家族的基因普遍外显子多。表达谱研究发现,属于AGO4和AGO1亚家族的MaAGO2,MaAGO3,MaAGO9三个基因在对解淀粉芽孢杆菌、荧光假单胞菌是都表现出表达的升高,这暗示着植物AGO基因参与的生物学过程可能参与植物对根际促生菌的响应,也有助于以后这方面的研究。