木薯AGPase酶活性及其同工酶位点检测

本文以3个亲缘关系较远的高产木薯品种(SC124,SC8和Arg7)为材料,对块根发育过程中的AGPase活性和淀粉含量进行了测定,并利用AGPase同工酶电泳技术(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)对AGPase酶活性较高时期同工酶位点进行检测,旨在分析木薯块根AGPase同工酶位点与AGPase酶活性和淀粉积累的关系。结果表明:木薯块根发育过程中AGPase酶活性和淀粉含量呈极显著正相关(R=0.80212),Arg7的AGPase酶活性和淀粉含量在块根发育都显著高于SC124和SC8。同工酶分析表明,木薯至少有6个同工酶位点(AGPa,AGPb,AGPc,AGPd,AGPe和AGPf),且品种间具有多态性。其中,3个品种共有的4个同工酶位点分别为AGPa、AGPc、AGPd和AGPf,AGPe位点只在Arg7中出现,初步判断同工酶位点AGPe可能与其较高的酶活性和淀粉含量有关。本研究为系统研究木薯品种间AGPase酶活性与淀粉积累的关系提供了参考。

VIGS诱导GS同工酶基因沉默对烤烟氮代谢的影响

【背景和目的】谷氨酰胺合成酶(GS)是烤烟氮代谢的关键酶,为探究沉默GS同工酶基因对烤烟氮代谢的影响。【方法】采用病毒诱导基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术构建GS同工酶基因(NtGS1、NtGS2)瞬时沉默表达载体,测定了烤烟品种中烟100叶片经VIGS处理10 d,20 d和30 d的NtGS1-1、NtGS1-2、NtGS2相对基因表达量和谷氨酰胺合成酶(GS)、硝酸还原酶(NR)活性以及叶片可溶性蛋白、总氮、烟碱含量和烟株生物量。【结果】沉默NtGS1基因的处理对NtGS1-1沉默效率最高为50.4%,对NtGS1-2沉默效率最高为56%,沉默NtGS1和NtGS2基因的处理对NtGS2沉默效率最高为54.9%;沉默NtGS1和NtGS2的烟株叶片重、GS、NR活性、可溶性蛋白、总氮、烟碱含量都显著低于对照。【结论】本研究建立的VIGS体系有效下调了GS同工酶基因的表达,同时沉默NtGS1和NtGS2(TRV::GS1::GS2)可抑制叶片氮素同化利用,降低氮代谢关键酶活性与含氮化合物含量。

木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因全长克隆

【目的】克隆木薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)小亚基基因cDNA全长序列,为木薯高淀粉品种的分子育种提供依据。【方法】根据木薯AGPase小亚基基因已知片段设计特异性引物,以木薯根、茎、叶为材料,利用PCR及RACE克隆木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列。运用生物信息学方法对其核苷酸序列和推导氨基酸的理化性质、蛋白质三级结构进行系统分析。【结果】克隆获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基cDNA全长1566bp,其中包括1566bp的完整ORF,编码一个含521个氨基酸的多肽。其理论蛋白质分子量57.01kDa,等电点6.1,呈酸性。多重序列比较分析结果显示,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基核苷酸序列与蓖麻、麻风树和杨树相应序列的相似性分别为87%、87%和86%。结合系统进化树分析结果推测,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基在不同物种及进化过程中具有高度的保守性。蛋白三级结构分析结果表明,木薯AGPase小亚基蛋白具有15个α-螺旋、24个β-折叠和多个转角。【结论】木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列与蓖麻、麻风树和杨树等具有较高的同源性。

肌酸激酶同工酶CK-MB的构建表达、抗体制备及初步鉴定

目的 构建异源二聚体CK-MB重组蛋白并制备其特异性基因工程抗体,以此作为CK-MB定量检测试剂盒的诊断原料,从而辅助临床急性心肌梗死的早期诊断,提高诊断的准确性。方法 通过共表达载体获取异源二聚体CK-MB并进行动物免疫,从而获取小鼠浆细胞;进一步使用单细胞光导系统分离抗原特异性小鼠单个B细胞,并通过单细胞PCR获取抗体轻重链的可变区基因序列后构建基因工程抗体。基于初步的功能验证筛选出候选抗体,并进一步通过棋盘滴定法探究最佳的配对方案,并利用双抗夹心ELISA原理初步组装CK-MB定量检测试剂盒。结果 成功获取CK-MB免疫原;通过单B细胞光导技术筛选出CK-MB抗原特异性小鼠单个浆细胞并制备出2株小鼠源基因工程抗体,且均具有识别天然CK-MB的能力;经由双抗夹心ELISA法筛选出两种配对方案,其拟合曲线的R~2均大于0.99。结论 成功制备出靶向CK-MB的小鼠源基因工程抗体,经由ELISA初步验证抗体的特异性和亲和力,为进一步开发高特异性、高灵敏度的CK-MB新型定量检测试剂盒奠定了坚实基础。

雌核发育牙鲆同工酶基因的重组及父方基因的表达

于 1 998年 4、5月在山东省荣成市寻山水产公司养鱼场人工采集牙鲆成熟精卵 ,紫外线灭活精子遗传物质 ,冷休克诱导 ,获得雌核发育牙鲆。 1 999年 5月收集 5 7尾雌核发育牙鲆生化样品 ,采用淀粉胶电泳分析了 LDH、IDHP、PGM、ACP、ADH、SDH、GDH、CAT等 8种在野生种群中为多态的同工酶。结果表明 ,牙鲆雌核发育群体的 Ldh- C、Cat两个基因座位发生了重组 ,基因座位与着丝点之间的重组率分别为 5 2 .6 %和 2 9.8% ;Idhp- 1有父方基因表达现象 ,说明雌核发育过程中父方基因可能在分子水平整合 ;牙鲆雌核发育群体的多态座位比例和平均杂合度分别为 7.0 %和 0 .0 3 5 ,远低于野生种群 ;研究表明 ,通过抑制第二极体排出获得的牙鲆雌核发育子代尚有一定基因杂合 。

声波刺激对铁皮石斛过氧化物酶同工酶基因表达的影响

从基因表达水平探索了植物适应物理应力刺激时可能作出的反应机制。以铁皮石斛组培苗为实验材料,以特定的声波(声强100dB、频率1000Hz)刺激为应力源,检测比较了声波刺激对铁皮石斛过氧化物酶(POD)同工酶酶谱及各酶带百分含量的影响;通过设计引物扩增出铁皮石斛POD基因片段,以此为探针,利用Northern点杂交技术检测分析了声波刺激对铁皮石斛POD基因表达的影响。结果显示,声波刺激没有引起铁皮石斛产生新的酶带,但促进了其POD同工酶酶量的提高;声波刺激对铁皮石斛POD基因表达的影响与其同工酶酶谱及其总RNA量的变化基本一致。表明声波刺激对植物POD同工酶基因表达有激活作用,可能引起植物某些基因转录和表达水平的变化。

泥蚶(Tegillarca granosa)个体发育过程中同工酶基因表达与调控的研究

采用不连续垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳法,对泥蚶(TegillarcagranosaLinnaeus)19个发育阶段的ADH、LDH、EST、IDH、ALP、MDH、GDH、POD、ATPase和ME等10种同工酶的基因表达进行检测分析。结果表明,泥蚶在个体发育过程中随着机体分化和生理活动的改变,同工酶基因的表达呈现出显著的时序变化。在10种酶中,LDH和ATPase两种酶的所有酶带及EST、MDH和ME等的部分酶带在各个发育阶段持续表达,其他酶带只出现在发育阶段的某一或某些阶段,并且表现出了与泥蚶营养方式、代谢形式等生理活动的关联性。在泥蚶的个体发育阶段过程中,IDH、MDH、GDH、ME、ALP等5种酶在32细胞期表达的酶带数剧增,因此32细胞期可能是合子基因表达启动的时间;ADH、EST、LDH、MDH、GDH、ME等6种酶在泥蚶的附着变态期酶带大幅减少或产生新酶带,可能与泥蚶附着期运动方式、代谢强度及生活环境的改变有关。

中国两性生殖卤虫同工酶基因的表达及分类地位

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法，对中国１１个不同地理品系两性生殖卤虫的１０种同工酶的基因表达情况和各品系卤虫的分类地位进行了研究。分析了编码１０种同工酶的２１个座位，４６个等位基因。实验和分析结果表明中国两性生殖卤虫各品系均属于Ａ．ｓｉｎｉｃａ，而不属于Ａ．ｕｒｍｉａｎａ。１０种同工酶中有７种酶为多态酶。ＮＬ、ＨＪＱ、ＳＢ品系为Ａ．ｓｉｎｉｃａ中较为原始的种类，而Ａ．ｕｒｍｉａｎａ在中国两性生殖卤虫的起源过程中具有重要作用。通过对Ａ．ｓｉｎｉｃａ的基因表达情况的分析和与其它五大两性种卤虫同工酶基因表达情况进行比较可以说明Ａ．ｓｉｎｉｃａ是由旧大陆古老两性生殖卤虫品系进化而来，与伊朗的Ａ．ｕｒｍｉａｎａ亲缘关系较近。

高温胁迫下水稻胚乳淀粉分支酶各同工型基因的表达特征

以稻米品质温度敏感型的早籼稻品种浙辐49为材料,利用人工气候箱控温处理试验和实时荧光定量PCR技术,探讨了水稻发育胚乳中淀粉分支酶(starch branching enzyme,SBE)的3种主要同工型基因(SBEⅠ、SBEⅢ和SBEⅣ)在不同温度处理下的相对表达量差异及动态变化特征。结果表明,高温处理对水稻胚乳中SBE基因的表达调控因其同工型的种类而异,SBEⅣ基因在高温处理下呈上调表达,而SBEⅠ和SBEⅢ基因在高温处理下的相对表达量则明显降低,表现为下调表达;与SBEⅣ等同工型相比,水稻胚乳中SBEⅠ基因对高温胁迫的表达响应相对更敏感。

白鲢个体发育过程中同工酶基因的表达与调控研究

采用淀粉或聚丙烯酸胺凝胶电泳及特异性组织化学染色技术研究了白鲢早期发育过程中（从未受精卵到卵黄吸尽期）及成体不同组织（脑、眼、心、肌、肾、肝）中六种同工酶系统（LDH，MDHIDHADHSDH，EST）的分化表达谱式。白鲢各同工酶基因的表达具有明显的组织特异性。早期发育过程中，ADH和SDH基因均无活性，其它四种同工酶则具有不同的个体发育谱式。值得一提的是，由取自同一地区的两对白鲢的受精卵的形成胚胎的LDH和EST同工酶的个体发育谱式具有明显的差异。这种差异很可能与不同白鲢母本的未受精卵中不同的同工酶组成有关。本文最后还提出了今后深入研究的有关问题。

盐胁迫对小麦过氧化物酶同工酶基因表达的影响

为了研究小麦过氧化物酶同工酶基因表达与盐适应性的关系,以小麦品种pH-82-2-2为材料对盐胁迫下过氧化物同工酶谱的变化进行了分析,结果表明,PH-82-2-2经盐胁迫后,根、叶中过氧化物酶同工酶发生显著变化,说明盐胁迫影响该基因的表达。盐胁迫对5个同工酶14个等位基因的表达产生不同的影响,有些基因只有在盐胁迫下才表达,如PX-2b等,有些基因的表达具有组织器官特异性,如PX-1等。盐胁迫下过氧化物酶同工酶基因表达水平的变化,说明小麦遭受盐胁迫后会通过控制基因的表达达到抵抗盐渍侵害的作用。

广西10例人芽囊原虫基因型和同工酶谱的研究

目的分析广西10个人芽囊原虫(Blastocystis hominis)分离株基因型,及其乳酸脱氢酶(LDH)和酯酶(EST)的同工酶谱特征。方法从感染者粪便中分离到的10个人芽囊原虫(BhGX1～BhGX10),体外培养并提取基因组DNA。用已知的7对特异性序列标记位点(sequene tagged sites,STS)引物PCR扩增,来鉴定基因型。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),分别进行乳酸脱氢酶和酯酶2种同工酶染色,比较分析10个分离株的酶谱。结果 10个人芽囊原虫分离株中有8个为基因Ⅰ型;另外2个分离株(BhGX4和BhGX7)经7对引物扩增均为阴性,为未知基因型。10个人芽囊原虫分离株在LDH谱中共出现10条酶带,常见酶带为Rm37、Rm49、Rm57、Rm68和Rm92;在EST谱中共出现12条酶带,其中Rm14、Rm18、Rm23、Rm27、Rm45、Rm50和Rm77酶带较常见。各分离株之间的LDH和EST同工酶谱均存在差异。结论广西10个人芽囊原虫分离株以基因Ⅰ型为主,但各分离株之间的LDH和EST同工酶谱存在差异。

编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD的克隆与高效表达

利用PCR技术从大肠杆菌(Escherichia coli)中扩增出1.16 kb的编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD,将其连接到温控表达载体pHsh,得到重组载体pHsh-yqhD,重组载体在大肠杆菌JM109中得到高效表达。SDS-PAGE分析显示:融合表达产物的相对分子质量均为43 000,同核酸序列测定所推导的值相符。对含有yqhD的基因工程菌进行表达研究表明:42℃诱导4 h,1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力达到100 IU/mg,而对照菌株的酶活力仅为0.5IU/mg。

苎麻胶质的基因型差异与成因及育种中利用的研究Ⅲ.苎麻胶质含量及其组分与过氧化物酶同工酶的关系

为了解苎麻胶质中各种成分的代谢机理 ,研究了 2 5份苎麻品种胶质含量及其组分与植株过氧化物酶(POD)同工酶的关系 .根据电泳图谱中 POD酶带的数目、迁移率和酶活性 ,将供试品种分为 4类 :仅第二酶带 (Rf=0 .5 4)活性强的为第 类型 ,仅第三酶带 (Rf=0 .5 9)活性强的为第 类型 ,第 类型的上述两条酶带活性均较强 ,第 类型则此二酶带活性均较弱 .苎麻胶质及胶质各组分的含量均以第 类型品种最高 ,第 类型品种最低 ,第 , 类型则介于上述二者之间 .POD活性与木质素含量的线性回归方程为 y=0 .2 75 - 0 .0 18x(r=0 .80 1* * ) .

鲤鲫人工多倍体谱系中同工酶和蛋白的基因表达

通过对红鲤、红鲫、镜鲤、鲤鲫杂种二倍体一代 ,二代 ,鲤鲫杂种三倍体 ,鲤鲫复合三倍体 ,鲤鲫杂种四倍体一代 ,二代的同工酶及蛋白电泳谱型和扫描数据分析表明 :在鲤鲫人工多倍体谱系中 ,亲代的等位基因在杂交子代中共有四种表达模式 :( 1 )两亲本基因在子代中共同表达 ,即共显表达 ;( 2 )父本的基因表达受到部分或完全的抑制 ,即母本的基因优先得到表达 ;( 3)母本的基因表达受到抑制 ,父本的基因得到表达 ;( 4 )双亲本的基因表达均受到一定程度的抑制或都不表达。其中第一种表达模式是主要的模式。根据以上基因在杂交子代中的表达特点 ,可用同工酶和蛋白电泳图谱将鲤鲫人工多倍体谱系的各种生物型逐一加以区分。

草鱼同工酶基因座位多态性的初步研究

采用垂直淀粉凝胶电泳及特异性组织化学染色技术研究了25尾草鱼的6种同工酶系统[ LDH ,MDH ,ADH, GDH, IDH, EST )约18—23个基因座位的遗传变异型。有7个基因座位(s-Mdh-A,Adh-B,Gdh-1,Gdh-2,Est-1,Est-6,Est-14)具有多态性,在其中4个基因座位(s-Mdh-A,Adh-B,Gdh-1,Est-1)上观察到的基因型频率与Hardy-Weinberg定律相符。实验表明草鱼的同工酶基因座位具有明显的多态性。这一结果为草鱼的人工选种和定向育种的可能性提供了依据。对草鱼GDH,EST同工酶的遗传基础、亚基组成以及酶变异的机理等问题进行了讨论。

两种泥鳅不同核质关系下LDH同工酶基因表达的研究

采用聚丙烯酰胺不连续系统凝胶电泳方法分析了泥鳅和大鳞副泥鳅不同杂交组合不同核质关系下胚胎发育阶段（０－１４５ｈ）中乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）同工酶的分化表达谱式，ＬＤＨ同工酶的基因表达随细胞质、细胞核不同及胚胎发育各个时期具有不同的个体发育谱式。以泥鳅卵子为细胞质的Ⅰ、Ⅱ两组，杂交组（Ⅱ）ＬＤＨ同工酶基因在受精后３ｍｉｎ至原肠中期雄核基因参与表达与调控，部分基因位点比本交组（Ⅰ）启动与表达的时间要早，两组的管家酶主要来自细胞质。以大鳞副泥鳅为细胞质的Ⅲ、Ⅳ两组，各酶均以细胞质调控为主，其管家酶与泥鳅有很大不同。并具体分析和讨论了不同核质关系下ＬＤＨ同工酶基因的表达和调控的时空顺序。

西方蜜蜂四个亚种酯酶同工酶型和苹果酸脱氢酶Ⅱ同工酶基因型的遗传差异

The esterase (EST) and the malate dehydrogenase Ⅱ (MDHⅡ) isozymes in A. mellifera carpatica (C), A. mellifera ssp.(D), “Zhejiang Agricultural University No.1” A. mellifera ligustica (Ea) and A. mellifera carnica (K), and the genotypes of MDHⅡ isozymes in four subspecies of A. mellifera were analysed by IEF PAGE. The results indicate that the four subspecies of A. mellifera showed the same EST zymogram, while A. cerana showed a different EST zymogram, which suggests that the genotypes of EST isozymes in A. mellifera are different from those in A. cerana. The genotypes of the MDHⅡ isozymes in four subspecies of A. mellifera were aa, ab, ac, bb, bc and cc. The C and Ea subspecies exhibited high homozyosity, while D and K displayed high heterozyosity. The allele b appeared to be the highest frequency in C, while the allele c had the highest frequency in Ea. The frequencies of the alleles a, b and c in sub species D were very similar. The alleles a and c were common, while allele b was rare in sub species K. There were highly significant differences in genotype frequencies, allele frequencies, homozyosity and heterozyosity among these four subspecies.

黑木耳种内杂交子同工酶基因座的遗传分析

从黑木耳 (Auriculariaauricula)种内杂交子H2 J3的子实体上单孢分离培养得到F1代 5 2个单核体菌株 ,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对杂交子H2 J3的单核体亲本 (H2 、J3)及F1代 5 2个单核体菌株进行EST、MDH和FDH 3个酶系统的同工酶分析。结果表明 ,黑木耳EST ,MDH和FDH 3个酶系统分别由 7个、5个和 4个基因座控制 ,其多态性基因座分别为 4个、1个和 0个 ,其中两个基因座 (EST - 5 ,EST - 6)之间存在紧密连锁关系。